抗HBV核酶的研究进展 .doc

1抗 HBV 核酶的研究进展 乙型肝炎病毒（HBV）是引起乙型肝炎的病原体在我国 HBV 感觉率达 10%，而传统的抗病毒药物远期疗效均不显著，寻找新型抗HBV 药物成为迫切需要 核酶（Ribozyme）是一类具有生物催化功能的 RNA，可定点切割 RNA 靶分子，从而达到有效阻断基因表达的目的[1] 通过合理的设计及操作，核酶可阻断 HBV 的复制及表达所以在基因治疗领域倍受重视 1 核酶的类型及设计 到目前为止，人们发现的核酶共有六种类型即Ⅰ类内含子、RNaseP、锤头状核酶、发夹状核酶、丁型肝炎核酶和 VS 核酶通过对这六类核酶组成及结构的研究，人们已经开始利用锤头状、发夹状核酶的特点，人工合成所需要的核酶Weizsacker[2]、汤华[3]竺来发等人[4]所设计针对 HBV 的核酶，均采用这种传统方式Hselh 等[5]则就 HDV 核酶研究对乙型肝炎病毒的阻断作用对于2核酶的合成，有两种方法①是用 DNA/RNA 合成仪直接合成②先合成核酶的双链或单链模板，然后用 T4DNA 连接酶将其整合并克隆至合适的表达载体，让其表达出核酶这是一种简单、实用的方法通过对这些核酶的深入研究，有助于有效控制 HBV 的感染。

2 提高核酶的稳定性 由于血清和细胞内含有大量的核酸酶，体内表达核酶存在被降解的可能因此目前大多数研究致力于提高体外合成核酶的稳定性修饰，也有关于体内表达核酶的稳定性的研究报道在体外许多研究针对 2’-OH 进行修饰，以增加核酶的稳定性如 Taylor 设计的 DNA-RNA 杂合核酶，即与底物配部分用脱氧核苷酸替代结果其体外活性提高 6 倍，稳定性提高 2 倍Heidenreich 则以 2’-氟替代，发现提高了稳定性但也降低了剪切活性[6]亦有以 2’-甲基，2’-脱氨，2’-氨基，磷硫替代等修饰的报道 核酶在细胞内提高稳定性则通过装在 tRNA 反密码环或在核酶末端引入茎环结构来进行连建奇在核酶两端设计顺式核酶也是一种有效的方法[7] 33 提高抗病毒效率的方法 ①体外进化 目前用的核酶，均为人工设计，但即使合理设计的核酶，催化效率也低于天然核酶根据 RNA 分子进行技术提出进行体外筛选方法，在抗 HIV 中已有报道，对抗 HBV 也是一种可行的方法②多位点核酶的联合作用，针对靶 RNA 分子的不同位点进行多位点破坏，进一步提高核酶的剪切率，这样既可防止 HBV的变异引起变异逃避，也可减少空间构型的影响。

许多设计都采用了这种思路，如 Weizsacker 所用三个核酶的串联作用③与定向技术相结合，如用 HBV 外膜蛋白包装含有 HDV 核酶的弱毒株，可使其定向作用于靶器官肝脏日本学者山田修平设计抗 HCV 的核酶时，使用唾液粘蛋白定向等等④核酶与反义技术相结合核酶与RNA 诱饵（decoy）相结合，这种方法在抗 HIV 核酶中已有许多研究，如 Homman 等人的报道，抑制效率可提高 4～7 倍[8] 4 目前的研究现状 4抗 HBV 核酶的研究是核酶应用研究的一个热点竺来发等人设计针对 HBcAgmRNA 编码序列的核酶在 Mg++存在下，将137nt 的核酸准确地水解得到 97nt 和 40nt 两个片段，可有效地剪切 HBV 的 mRNA王平等人针对 HBV 的前 c/c 基因设计了锤头状核酶，经体外转录后可定点切割靶 RNA[9]同时在 HepG2 细胞中亦可显著抑制 HBeAg、HBsAg 的表达Weizsacker 构建了串联的核酶，分别针对 HBV2029、2044、2049 位点，结果表明三个核酶同时具有剪切作用，Beck 设计也针对 HBV 包装点的锤头状核酶，体外剪切靶 RNA，用 U6snRNA 表达核酶与 HBV 共转染，也可有将效切割 RN[10]。

Hsieh 则将丁型肝炎核酶改造，利用外膜为HBsAg 的特点可将抗 HBV 的核酶靶向导入肝细胞中，为乙型肝炎治疗提供了一条新途径Welch 使用三个发夹状核酶，在 Huh7细胞中与 HBV 共表达，使其表达下降 66%，对核酶修饰后，则抑制率达 83%真核细胞表达的成功，预示对 HBV 基因治疗是可行的[11] 5 存在问题及展望 抗 HBV 核酶的体外、体内的应用研究已取得了很大进展，但目前还有诸多问题问题尚待解决，如怎样选择敏感的靶位点，如何使核酶进入细胞，如何提高核酶的稳定性等但就技术本身的发5展潜力巨大从已经进行的抗 HIV 核酶Ⅰ期临床实验中，我们已经看到了抗 HBV 核酶发展的曙光 参考文献 1 Kruger k,Grabowski PJ,Zaug AJ,et al.Selfsplicing RNA:Autoexcision and autocy clixation of the ribosomal RNA intervening sequence of tetrahymena.Cell,1982,31:147. 2 Weizsacker f,Blum H,Wands JR,Cleavage of hepatitis B virus RNA by three ribozyme transcribed from a single DNA template.Biochem Biophys Res commun,1995,214(1):36. 3 汤华，闻玉梅，何丽芳。

核酶的体外合成及其对鸭乙型肝炎病毒 S 基因体外转录物的定点切割病毒嘡报， 1994，10 （4）：307 64 竺来发，易荣大，陆长德，等乙型肝炎病毒 adr 亚型核心抗原 RNA 片段的体外 ribozyme 定点切割生物化学与生物物理学报，1993，25 （3）：313 5 Hsieh sY,Taylar J.Delta virus as a vecter for the delivery of biologically-active RNAs possibaly a ribozyme specific for chronic hepatitis B virus infection.Adv Exp med Biol,1992,312:125 6 Hiedenreich o.Eckstain F.Hammerhead ribozyme mediated cleavage of the long termmal repear rNA of human immunodeficiency virus type 1.J Biol chem.,1992,267(3):1904 7 连建奇，周永兴，金由辛。

抗 HBV c 区基因核酶自剪切转录载体的构建第四军医大学学报，1997，18（4） ，371 8 Homann m,Tzortzakaki S,Rittneark,et al.Incorporation of the catalytic domain of a hammer-head ribozyme into 7antisense RNA enhances its inhibitory effect on the replication of human immu nodeficiency virus type 1.Nucleic Aids res,1993,21:28009 9 王平，徐炜，曾力宇，等核酶 Ripc 对 HBV 基因体外转录物的作用病毒学报，1993，9（3 ）：278 10 Beck j,Nassal M.Efficient hammerhead ribozyme-mediated cleavage of the structured hepatitis Bvirus encapsidation signal in vitro and in cell extracts,but not in intact cells.Nacleic Acids Res,1995,23(24):4954. 11 Welch pJ,Tritz R,Yei S,et al.Intracellular application of hairpin nbozyme genes against hepatitis B virus.Gene Ther,1997,4(7):736. 。