抗体库技术课件.ppt

第十三章第十三章 抗体库技术抗体库技术鲍永华鲍永华()()新乡医学院免疫学教研室Niels K. JerneGeorges J.F. KhlerCsar Milstein丹麦CAntigenBADBCADabcdAntibody aAntibody bAntibody cAntibody d多克隆抗体的制备单克隆抗体的制备基因工程抗体技术20世纪80年代, DNA重组技术发展使制备部分或全部人源化的基因工程抗体成为可能，因此产生了基因工程抗体技术第一节 抗体库技术进入20世纪90年代，组合化学技术与基因工程抗体技术相互结合产生了抗体库技术从此抗体工程技术进入了一个新的发展阶段抗体库技术的产生基于两项关键技术的突破：PCR技术的出现和发展使人们能够使用一套引物扩增出全套免疫球蛋白可变区基因;利用大肠杆菌成功表达出具有抗原结合功能的抗体分子片段 概 念所谓抗体库(antibody library)技术,就是用基因克隆技术克隆全套抗体重链和轻链可变区基因,然后重组到特定的原核表达载体中,再转化大肠杆菌以表达有功能的抗体分子片段,并通过亲和筛选获得特异性抗体可变区基因的技术 抗体库技术经历了组合抗体库、噬菌体抗体库、核糖体展示(ribosome display)抗体库3个发展阶段。

英国剑桥的Ward等最早尝试了抗体库的构建，他们用PCR从溶菌酶免疫后的小鼠脾细胞DNA扩增出VH基因,测序证实了其多样性,在大肠杆菌表达出VH段(单区抗体),检测2000个克隆得到21个可以与溶菌酶特异结合的克隆这一工作未构建完整的抗原结合部位(无轻链),也未提出有效的筛选方法,但它表明了抗体库技术的可行性 2个月之后，Science上发表了美国Scripps研究所Huse等的完整的抗体库工作,他们用逆转录-PCR技术从淋巴细胞克隆出抗体轻链基因repertoire和重链Fd段基因repertoire,将两者分别组建到噬菌体表达载体中（如下图）组合抗体库的表达载体Fab=VL+CL (L) VH+CH1(Fd)Fab片段结合抗原Fc=CH2+CH3A：重链载体 B：轻链载体 C：组合后的Fab段表达载体抗体库技术较细胞融合杂交瘤技术制备单抗有着明显的优越性： 1.抗体库技术省去了细胞融合的步骤,省时省力,避免了因杂交瘤不稳定而需要反复亚克隆的繁琐程序2.扩大了筛选容量,用杂交瘤技术一般筛选能力在上千个克隆以内,而抗体库可筛选106以上个克隆3.抗体库技术直接得到抗体的基因,既无杂交瘤丢失之虞,又便于进一步构建各种基因工程抗体。

4.抗体库技术得到的抗体可以在大肠杆菌表达,可利用原核表达系统的优势5.一些难于制备的抗体,如针对弱免疫原、毒性抗原的抗体,以及人源抗体的制备可以得到解决组合抗体库技术出现后不到一年, 即被噬菌体抗体库技术所代替, 该技术是在噬菌体表面展示(phage display)技术基础上建立起来的, 是迄今为止发展最成熟、应用最为广泛的抗体库技术 1985年Smith 证实噬菌体fd基因组能通过基因工程的手段进行改造1988年Parmley 将已知抗原决定簇与噬菌体P N端融合呈现在其表面1990年McCafferty 用噬菌体展示技术筛选溶菌酶的单链抗体成功使噬菌体展示技术进入一个广泛应用的时代一系列噬菌体文库的构建噬菌体展示技术焕发出了新的生命力第二节 噬菌体抗体库技术一、噬菌体展示技术的原理噬菌体展示技术的原理在噬菌体衣壳蛋白基因中插入外源基因，形成融合蛋白表达在噬菌体颗粒蛋白的表面，被展示的多肽或蛋白质可保持相对独立的空间结构和生物学活性Phage Display of PeptidesSelection From Library of Random MutantsRandom Library ofDNA SequencesGene 3 or 8+Gene 3 FusionsEach Phage DisplaysOne Peptide SequenceTranslated from DNA to Peptide in E. coli非展示系统 展示系统 噬菌体展示技术最关键的优势有三：第一：淘选的高效率使得在极低的存在 水平下，挑选到高亲和力噬菌体成为可能；第二：所挑选到的噬菌体可在微量存在的情况下，通过感染细菌得到富集；第三：展示的多肽或蛋白质与其包含在噬菌体内部的基因密码的连接，使得结合肽或蛋白质的序列分析既快速又简便。

二、噬菌体抗体库的构建噬菌体抗体库技术(phage display antibody library techniques) 是指用聚合酶链反应(polymerase chain reaction ,PCR) 扩增抗体的全套可变区基因,通过噬菌体表面展示技术,把Fab 段或单链抗体(ScFv) 表达在噬菌体的表面,经过“吸附-洗脱-扩增”过程筛选并富集特异性抗体构建Fab抗体库和ScFv抗体库的差别页VHVLCLCH1CH2CH3Hinge(Fab)2FabFcMembraneExtensionAntibody IgG structureVHVLCLCH1CH2CH3FvFvVHVLscFvVHVLSingle Chain Fragment variable免疫球蛋白基因可来源杂交瘤细胞体外免疫的细胞致敏及非致敏的B 淋巴细胞(骨髓、外周血)病灶局部引流淋巴结扁桃体或经过免疫的小鼠脾脏等其中以淋巴结的B 淋巴细胞较好单链抗体(ScFv) 表达在噬菌体的表面 噬菌体表面展示文库技术的要点噬菌体表面展示文库技术的要点: : 外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N N端端将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因 g3g3或或g8 g8 的先导系列的紧靠下游的先导系列的紧靠下游随机克隆入相应载体形成组合文库随机克隆入相应载体形成组合文库从免疫或未被免疫的从免疫或未被免疫的B B细胞中细胞中PCRPCR扩增抗体全套基因片段扩增抗体全套基因片段用固相化抗原经用固相化抗原经“ “亲和结合一洗脱一扩增亲和结合一洗脱一扩增” ”数个循环直接、数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。

体噬菌体库使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内，形成游离的抗体使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内，形成游离的抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体筛选到的噬菌体再将基因筛选到的噬菌体再将基因g3g3或或g8g8切除后，转入大肠杆菌，切除后，转入大肠杆菌，首先提取细胞的总首先提取细胞的总RNA ,RNA ,经过经过RTRT- -PCR PCR 扩增可变区基因扩增可变区基因酶切酶切轻链轻链PCR PCR 产产物和表达载体物和表达载体二者连接，转入感受态细胞中扩增二者连接，转入感受态细胞中扩增成为轻链库成为轻链库重链的重链的PCRPCR产物产物酶切酶切酶切酶切二者按照一定比例连接二者按照一定比例连接转化入感受态细胞转化入感受态细胞加入噬菌体加入噬菌体收集噬菌体颗粒收集噬菌体颗粒噬菌体总抗体库噬菌体总抗体库表达载体噬菌体抗体库的表达载体可分为 噬菌体(phage) 、单链丝状噬菌体(filamentous phage) 及噬菌粒(phagemid) 三种系统噬菌粒是应用最多的表达载体,也是简便高效模拟B 细胞产生抗体的原核表达系统Antibody Gene IsolationAntibody binding specificities are defined by the variable regions of the heavy (VH) and light chains (VL). The DNA encoding the VH and VL genes are amplified by PCR from human B lymphocytes and are joined together by DNA encoding a flexible peptide linker. This combinatorial assembly creates a whole repertoire of antibody genes encoding many different antibody fragments in the form of single chain Fvs (scFvs). Phage display vector & Library GenerationThe population of antibody scFv genes are cloned in a phage display vector to create a fusion with the phage coat protein. In this way a library is created in bacteria经典的筛选方法有两种290页一是将纯抗原包被在固相介质上,如酶标板、免疫试管或亲和层析柱,然后加入待筛选的噬菌体,洗去非亲和性的噬菌体,回收高亲和性的噬菌体。

固相筛选）二是将抗原与生物素基团相连,再将其固定在包被有链霉蛋白抗生素的顺磁珠上对噬菌体进行筛选液相筛选）三、噬菌体抗体库技术优势（一）能模拟天然抗体库,不需要免疫人和动物在噬菌体抗体库中, 含有人抗体各种基因信息的全部mRNA ,为全套抗体基因的获得提供了良好材料构建噬菌体抗体库时,抗体重链基因和轻链基因在体外的重组,造成重、轻链间的配对具有很大的随机性, 一般认为,107个特异性抗体分子就能识别全部抗原决定簇的99 %因此,构建一个库容量为108的组合噬菌体抗体库,理论上认为基本上包括了所有的抗体分子二）适应于大规模工业化生产DNA 操作是在细菌中增殖,比杂交瘤技术简单快速,制备单抗从取脾细胞到稳定的克隆株至少需要数月,而噬菌体抗体库技术最短只需几周的时间三）可获得不同亲和力的抗体在构建噬菌体抗体库时,抗体重链与轻链基因的重组,就模拟了机体内抗体亲和力的成熟过程在噬菌体抗体库中,抗体重链与轻链间的配对存在着很大的随意性,这往往能改变B 细胞中原有的抗体重、轻链间的配对方式,产生出不同亲和力的抗体四、噬菌体抗体库的应用研制疫苗和诊断试剂 有学者用乙肝病人的阳性血清中的抗体从噬菌体随机肽库中分离到乙肝病毒特异性的噬菌体模拟肽；Lundin 等对HIV-1 病毒也做了相应的研究,从噬菌体抗体库中分离到能够诱发针对HIV-1 的免疫反应的噬菌体肽。

表位研究确定核酸结合蛋白 通过构建锌指的随机肽库,采用核酸作为靶分子进行筛选,可以得到其相应的结合蛋白药物开发 利用噬菌体肽库的多样性,筛选出能同受体特异结合的重组噬菌体多肽，可作为受体的激动剂或拮抗剂基因治疗 有学者将呼吸道内皮细胞暴露于随机肽库中,筛选出与之相结合的高亲和力的肽分子,分离相应基因,以重组腺病毒作为载体将外源基因导入呼吸道内皮细胞内,使外源基因得到高效表达,治疗效果明显 单克隆抗体 噬菌体抗体 杂交瘤技术 展示技术宿主细胞: 杂交瘤 细菌筛选范围 : 103 107109时间: 几个月 几周操作: 繁杂 相对简单免疫: 必须 可避免人源抗体: +费用: 高 低生产量: 有限 无限基因获取: 再克隆 直接应用前景: 有限 不可估 前 景 噬菌体抗体库技术的发展具有很大优越噬菌体抗体库技术的发展具有很大优越性它简单易行，筛选容量大，效率高性它简单易行，筛选容量大，效率高，绕过了细胞融合及免疫等步骤，而且，绕过了细胞融合及免疫等步骤，而且在表型一基因型的统一和识别一增殖过在表型一基因型的统一和识别一增殖过程上模拟了程上模拟了B B细胞的成熟过程，从而在实细胞的成熟过程，从而在实际应用上具有很大意义。

际应用上具有很大意义第三节 选择性感染噬菌体展示抗体库技术选择性感染噬菌。