浙江大学刘振伟教授高级培训班膜片钳技术数据处理与分析.ppt

Clampfit 10膜片钳实验数据的处理与分析2014年4月23-25日杭州 浙江大学膜片钳技术高级培训班膜片钳技术高级培训班刘振伟刘振伟一、一、膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理二、二、全细胞记录数据的分析全细胞记录数据的分析三、三、单通道记录数据的分析单通道记录数据的分析四、四、突触放电活动数据的分析突触放电活动数据的分析2Patch clamp training classApr. 23-25, 2014内容内容3Patch clamp training classApr. 23-25, 2014膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理一、基线的调零一、基线的调零二、坏点的去除二、坏点的去除三、滤波三、滤波四、数据文件内部四、数据文件内部/ /之间的数学运算之间的数学运算4Patch clamp training classApr. 23-25, 2014膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理一、基线的调零一、基线的调零l 基线的确认基线的确认 Ø全细胞记录基线易确认，单通道记录基线不易确认• 单通道开放时间较长• 所记录的时间较短• 同时开放的通道数目较多且长时间持续开放Ø确定通道电流的方向：电流方向向上，最负向是基线位置，反之亦然。

如何确定：膜片两侧液体、钳制电位单通道电流基线的确认单通道电流基线的确认如果通道开放时电流向上，则基线在最下面的位置基线通道开放5Patch clamp training classApr. 23-25, 2014膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理6Patch clamp training classApr. 23-25, 2014膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理l 基线基线不在零点不在零点的的原因原因Ø  封接电阻的改变：漏电流Ø 失调电位的存在：偏移、漂移Ø 噪声的干扰：交流干扰Ø 高通滤波的影响：对记录线的起始部位产生影响7Patch clamp training classApr. 23-25, 2014膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理l 基线基线调零方法调零方法打开Analyze/Adjust/Baseline（1）Subtract mean of（去除均值法）：适用于去除直流偏移2）Subtract slope of（去除斜率法）：适合于去除持续线性漂移3）Subtract fixed value（去除固定值法）：适用于去除直流偏移数值有正负之分。

4）Adjust manually（手工调零法）：适合于单通道电流的基线或基线漂移无规律8Patch clamp training classApr. 23-25, 2014膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理坐标零点坐标零点Epoch A段（1）Subtract mean of（去除均值法）（2）Subtract slope of（去除斜率法）9Patch clamp training classApr. 23-25, 2014膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理（3）Subtract fixed value（去除固定值法）        （4）Adjust manually（手工调零法）10Patch clamp training classApr. 23-25, 2014膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理l 基线调零的注意事项基线调零的注意事项（1）有些只相对值（如电流幅度的变化值），不需要将基线调零但多数情况需要基线调零，建议都要进行基线调零2）对于基线变动复杂的数据，基线调零可能会用到上述的几种方法3）对于某些基线变动，Clampfit中的基线调零方法可能也无法准确调零。

建议最好在采集数据时就设法调整好基线11Patch clamp training classApr. 23-25, 2014膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理l Clampfit演示基线调零方法演示基线调零方法12Patch clamp training classApr. 23-25, 2014二二、、坏点的去除坏点的去除l 坏点产生的原因坏点产生的原因 Ø 刺激伪迹：给标本施加刺激时产生Ø 电容瞬变电流：电容的充放电反应Ø 瞬时脉冲干扰（Glitch）：打开电源开关（日光灯、仪器设备开启时）Ø 来电：一过性高频Ø人手靠近记录探头：高幅、高频膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理13Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 坏点的赋值坏点的赋值   （1）Data value at cursor 1：Cursor 1的数值  （2）Mean between cursor 1..2：Cursor 1-2之间均值  （3）Mean between cursor 3..4：Cursor 3-4之间均值  （4）Straight -line fit between cursor 1..2：Cursor 1-2之间的直线拟合值。

  （5）Fixed value(pA/mV)：输入一个固定的数值膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理14Patch clamp training classApr. 23-25, 2014膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理l Clampfit演示去除坏点演示去除坏点15Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 注意事项注意事项 （1）坏点太多时，应在记录前予以去除2）坏点持续时间短，如果出现持续时间较长的坏点，则数据要废弃膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理16Patch clamp training classApr. 23-25, 2014三三、、滤波滤波l 信号采集前的滤波信号采集前的滤波 Ø 全细胞通道电流记录：1-2 kHzØ 全细胞突触活动记录：10 kHzØ 单通道电流记录：10 kHzØ 动作电位记录：10 kHz膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理17Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 信号采集后的滤波信号采集后的滤波 膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理18Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 Lowpass Highpass Bandpass Notch Electrical Interference l Clampfit滤波类型滤波类型 膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理19Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Lowpass Ø 最为常用。

Ø Clampfit根据采样定理与Nyquist定理自动算出f-3dB范围并显示在该框底部Ø 7种类型：（1）8-pole Bessel：数据失真小，普遍用于时域数据2）Boxcar：数码滤波器，用于时域数据当前数据点及其前后一些数据点（取决于Smoothing points，取3-99中的奇数）的平均值赋予当前数据点，完成滤波            Smoothing points值越大，数据幅度削减越大     （3）Gaussian：数码滤波器，同Boxcar，但当前数据点在平均值中所占的比例较大4）RC (8-coincident-pole)：用于时域数据5）RC ( single-pole)：用于时域数据6）8-pole Butterworth：用于频域数据7）8-pole Chebyshev：用于频域数据  膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理20Patch clamp training classApr. 23-25, 2014膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理l Clampfit演示演示Lowpass滤波滤波21Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l HighpassØ又称交流耦合（AC Coupling），可削弱低频信号而通过高频信号。

Ø Clampfit提供两种：8-pole Bessel，单极RCØ 采用- f-3dB ，Clampfit自动计算出f-3dB范围并显示在该框底部Ø最常见的是在神经元上进行细胞内记录时使用高通滤波器，它可降低膜电位的低频振荡对突触电流的干扰膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理22Patch clamp training classApr. 23-25, 2014膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理l Clampfit演示演示Highpass滤波滤波23Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l BandpassØ相当于低通滤波与高通滤波的交叉，需要同时设定高通滤波与低通滤波Ø高通滤波的f-3dB不能高于低通滤波的f-3dB Ø带通滤波用于欲记录的信号频率较为单一和固定时，对其它频率的噪声进行滤波膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理24Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l NotchØ带阻滤波：削弱某一特定频率（如50 Hz交流）信号Ø中心频率（Center frequency）：10-3,000 Hz。

Ø频率宽度（–3dB width）：频率宽度3dB width越窄，滤波需要的数据点越多，滤波效果越好膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理25Patch clamp training classApr. 23-25, 2014膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理l Clampfit演示演示Notch滤波滤波26Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Electrical Interference（（EI））Ø电干扰滤波器（Electrical interference filter, EI）为数码滤波器Ø可同时去除50 Hz及其谐波（100 Hz、150 Hz等）的复杂交流噪声ØHarmonics from 1 to：用于设定欲去除的交流谐波的最高数目，最大数目为20（对应于1 kHz），一般去除第1-3个就够了ØCycles to average：数目越大，-3dB频率宽度越窄，滤波效果越好，但需时越长ØReference frequency：选50 Hz膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理27Patch clamp training classApr. 23-25, 2014EI所需最少数据点的计算举例所需最少数据点的计算举例Ø滤波器所需最少数据点＝ （采样频率/ 50 Hz）× Cycles to average若采样频率＝ 10 kHz，则一个50 Hz正弦波周期的采样点数＝ 10 kHz / 50 ＝200 点若设定Cycles to average ＝ 10，则需要的最少采样点数＝ 2,000点Ø采样数据点不够的话，将不能清除谐波干扰。

膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理28Patch clamp training classApr. 23-25, 2014四四、数据文件内部、数据文件内部/ /之间的数学运算之间的数学运算l Analyze/Average TracesØ平均文件内任意几条相同的Trace，获得平均后的一条TraceØ要求：    Clampex软件的Fixed-length events、Episodic stimulation和High-speed oscilloscope模式    重复记录的信号，时程必须固定不变膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理29Patch clamp training classApr. 23-25, 2014 降低信号噪声降低信号噪声Ø信号频率谱与噪声频率谱一致或有重叠时，滤波不行Ø平均Trace的原理：设有N条Trace，则（见表）：•先累加所有N条Trace，此时信号幅度增大为原来的N倍，而噪声却只增大为原来的√N倍•然后再除以Trace条数N，    信号幅度不发生大的变化，而噪声幅度却降低为原来的1/√N膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理30Patch clamp training classApr. 23-25, 2014膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理l Clampfit演示演示Average Traces功能功能31Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Analyze/Segmented AverageØ可对几个Trace中的某一相同时段（如Epoch A）或Cursor 1-2之间的时间段进行平均，平均后的文件通常用于Analyze/Subtract Control功能中的Control File。

膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理32Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Analyze/ArithmeticØ对文件内的任何Trace进行加减乘除等运算，使原来的Trace得到新值    如t3=t1+t2，t3=2t1+3t2ØResults窗口中的该功能可对不同Column的数据进行运算，得到新的Column的数值膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理33Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Analyze/ Average FilesØ对几个文件进行平均Ø例如在进行相同的实验时，需要将几个采样文件相应的每一个Trace进行平均平均后的文件会自动生成，文件名为Average000-999.abfØ仅适用于Episodic Stimulation、High-speed oscilloscope模式的数据；Protocol设置必须一致Ø同样具有降低噪声的作用膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理34Patch clamp training classApr. 23-25, 2014膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理l Clampfit演示演示Average Files功能功能35Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Analyze/ Subtract ControlØ两个文件中所有相应的Trace进行相减，可用于去除漏电流或分离某种通道电流。

Ø要求两个文件要采用相同的Protocol来采集（信号数目、Sweep数目与长短、信号单位、采样频率）ØTest file为“大”文件——“被减数”，Control File为“小”文件——“减数”Ø Multiply control traces by: 将Control File中的Trace乘以该倍数，然后再从Test file中减除膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理36Patch clamp training classApr. 23-25, 2014膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理l Clampfit演示演示Subtract Control功能功能37Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 注：注：Ø如需要，可用Analyze/Data Reduction或Interpolation功能使采样频率变为一致Ø若Test file中的Signal或Sweep数少于Control file，后者多余的Signal或Sweep将不被使用反之，若Test file中的Signal或Sweep数大于Control file，后者最后一个Signal或Sweep将被反复使用。

Ø若Test file中的Sweep长度小于Control file，后者Sweep中多余的点将不被使用反之，若Test file中的Sweep长度大于Control file，后者Sweep中最后一个点将被反复使用膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理以Test file为准38Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Analyze/Concatenate FilesØ将在同一条件下获得的数据文件并成一个文件同一条件是指相同的采集模式/采样频率/采样时间/信号个数Ø连接后的文件会自动生成: Concatenate000-999.abf膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理39Patch clamp training classApr. 23-25, 2014膜片钳实验数据的处理膜片钳实验数据的处理l Clampfit演示演示Concatenate Files功能功能40Patch clamp training classApr. 23-25, 2014全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析一、一、离子通道的激活曲线离子通道的激活曲线二、二、离子通道的离子通道的I-VI-V曲线曲线三、三、离子通道的衰减离子通道的衰减四、四、离子通道的失活曲线离子通道的失活曲线五、量效曲线五、量效曲线41Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l膜两侧电压差ΔVm改变，激活离子通道，用激活曲线描述。

    反映通道开启的速度速度及难易程度难易程度全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析一一、、离子通道的激活曲线离子通道的激活曲线42Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l给予细胞一系列脉冲电压来记录全细胞电流，作通道的激活曲线：    X轴——脉冲电压Vm    Y轴——全细胞通道电导g/gmax    Boltzmann方程拟合全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析43Patch clamp training classApr. 23-25, 2014g：全细胞通道激活电导gmax：全细胞通道最大激活电导Vm：不同的去极化（或超极化）脉冲电压V1/2：通道激活50%时的脉冲电压k：斜率因子（反映激活速度快慢，k越大，激活速度越慢）全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析lBoltzmann方程44Patch clamp training classApr. 23-25, 2014设：f(V) = gImax=gmax=1Vmid=V1/2V=VmVc=kC=0则即为前述的激活曲线方程：全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析lClampfit中的Boltzmann方程：Boltzmann, charge-voltage方程45Patch clamp training classApr. 23-25, 2014Ø 先对数据进行处理（如基线调零、滤波、选择用于分析的Sweep数目等）。

Ø 测量不同去极化脉冲电压下全细胞电流的峰值I（pA）Ø 计算全细胞电导g＝I / (Vm－Vrev)Ø 对全细胞电导g进行标化：g / gmax，gmax=Imax / (Vm-Vrev)Ø 作点图Ø 最后用激活曲线方程对散点图进行拟合全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析l 离子通道激活曲线制作步骤离子通道激活曲线制作步骤46Patch clamp training classApr. 23-25, 2014全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析l Clampfit演示激活曲线的制作演示激活曲线的制作47Patch clamp training classApr. 23-25, 2014全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析l 几点说明几点说明（1）通过激活曲线的左移或右移以及半失活电压的变化等指标可以判断药物对通道开启过程的影响2）若要反映一类通道的激活特点或对不同组数据进行比较，需要有细胞例数上的要求，要求出平均g/gmax值与标准差，再作激活曲线3）通道反转电位可通过Nernst方程计算出来，也可直接测试出来，后者更准确48Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l离子通道电流-电压关系曲线（I-V曲线）：    反映通道：激活过程、阈电位、反转电位、整流特性l给予连续变化的步阶/斜坡脉冲电压Vm（范围大，最好跨越反转电位），测通道电流大小I，作I-V曲线： X轴——Vm Y轴——Il药物可影响通道激活或衰减，使  I-V曲线形状发生改变。

全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析二二、、离子通道的离子通道的I-VI-V曲线曲线49Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 用用Analyze/Quick Graph/I-V作作I-V曲线曲线适用于脉冲电压为歩阶（方波）形式的记录数据全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析50Patch clamp training classApr. 23-25, 2014全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析l Clampfit演示演示用用Quick Graph/I-V作作I-V曲线曲线51Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 注意事项注意事项（1）通道未开放时，电流应该为零因此要对基线进行细致的调零，可能要对每个Trace都进行基线调零全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析52Patch clamp training classApr. 23-25, 2014（2）若要在一个细胞上测量多次，可选择Clampex中Edit Protocol的Run功能，也可用Analyze/Average Files功能进行文件间的平均，得到某一个细胞的电流平均幅度值。

全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析53Patch clamp training classApr. 23-25, 2014（3）测量同一种类多个细胞的I-V曲线，需要对电流幅度标化•原因：细胞大小不同，通道电流幅度不同•对于一个球形细胞，膜电容Cm＝πd2 / 100 (pF)  （d为细胞直径(μm)）    例子：若细胞直径d=20  μm，其膜电容Cm=12 pF•电流密度：I/ Cm ，I/ Cm -V曲线•Cm值的获得：（a）封接过程直接获得（b）Online Statistics窗口采集Cm ，最后获得平均Cm值•I/Imax-V曲线全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析54Patch clamp training classApr. 23-25, 2014（4）如果从钳制电位开始去极化（或超极化），在I-V曲线上应不包含钳制电位这个数据点全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析Vhold = -60 mV55Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 用用Analyze/Quick Graph/Trace vs. Trace作作I-V曲线曲线适用于脉冲电压为斜坡（Ramp）形式的记录数据。

全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析56Patch clamp training classApr. 23-25, 2014全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析l Clampfit演示演示用用Quick Graph/Trace vs. Trace作作I-V曲线曲线57Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 注意事项注意事项用用（1）Cursor 1、2的位置要放置准确，不要由于放置的误差导致出现错误为了更好、更准确地放置Cursor，应该：（a）在采集时设计好Protocol全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析不好好58Patch clamp training classApr. 23-25, 2014（b）应该以电流线（而不是Waveform电压线）为准设置Cursor因为电流线滞后全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析1电流线Waveform22159Patch clamp training classApr. 23-25, 2014（2）可通过选择对话框中的Append，将两条I-V曲线作在一个图中全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析60Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 通道在激活因素（一般为去极化）持续存在条件下的失活——衰减（Decay）    衰减的指标：（1）时间常数；（2）10-90%衰减时间。

全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析三三、、离子通道的衰减离子通道的衰减CurrentWaveform61Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l衰减的时间常数衰减的时间常数通道电流的衰减过程可用单指数方程或者双指数方程拟合，获得衰减的时间常数Clampfit软件中“Exponential, standurd”指数拟合方程：全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析τ：衰减的时间常数i=2时，为双指数方程，拟合后获得τ1和τ2两个时间常数值62Patch clamp training classApr. 23-25, 2014全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析l Clampfit演示演示衰减的拟合衰减的拟合63Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 10-90%衰减时间衰减时间打开Analyze/Statistics窗口，除设置其他选项外，要在Measurement中勾上Rise time, From 10 To 90%OK后，在Window/Results窗口中可查看到结果全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析64Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 给予细胞膜一个电压刺激，持续一段时间后，开放了的通道会逐渐失活，再给予电压刺激时，失活的通道将不再开放——稳态失活（Steady-state inactivation）。

用失活曲线反映全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析四、离子通道的失活曲线四、离子通道的失活曲线2nA10ms-50mVConditioning pulsesTesting pulsesVh= -90mV65Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l失活曲线采用双脉冲设置的Protocol来获得数据条件脉冲——将膜钳制在不同的电位水平，使相应部分通道处于完全失活状态测试脉冲——检测未失活通道的电流大小 X轴——条件脉冲的电压数值 Y轴——测试脉冲的电流大小    用Boltzmann方程拟合全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析2nA10ms-50mVConditioning pulsesTesting pulsesVh= -90mV66Patch clamp training classApr. 23-25, 2014I：不同条件脉冲电压下测试脉冲诱发的电流大小Imax：不同条件脉冲电压下测试脉冲诱发的最大电流Vm：不同条件脉冲电压V1/2：通道失活50%时的条件脉冲电压k：斜率因子（反映失活速度快慢，k越大，失活速度越慢）全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析lBoltzmann方程VmImax /2V1/20Imax67Patch clamp training classApr. 23-25, 2014全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析lClampfit中的Boltzmann方程：Boltzmann, charge-voltage方程设：f(V) = IImax=－1Vmid=V1/2V=VmVc=kC=1则即为前述的失活曲线方程：68Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 失活曲线制作步骤失活曲线制作步骤（1）对数据进行分析前的处理：基线调零、滤波等。

2）测量不同条件脉冲下的测试脉冲诱发的全细胞电流峰值（I）以测试脉冲的全细胞最大电流峰值Imax为1，对其它电流标化，计算出I/Imax3）以Vm为x轴，I/Imax为y轴，作点图4）最后用失活曲线方程对散点图进行拟合打开Clampfit中的Fit窗口，选择Boltzmann, charge-voltage方程全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析69Patch clamp training classApr. 23-25, 2014全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析l Clampfit演示失活曲线的制作演示失活曲线的制作70Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 几点说明几点说明（1）通过失活曲线的左移或右移以及半失活电压的变化等指标可以判断药物对通道失活过程的影响2）同通道激活曲线一样，若要比较不同组之间的差异，作失活曲线也需要有细胞例数（n）上的要求，要求出平均I/Imax值与标准差，再作失活曲线3）在作失活曲线时，脉冲电压的设定要注意：•条件脉冲时间要设定得足够长，以使通道在某一去极化水平的失活达到完全，这需要根据通道的失活特点来设定。

      Na+离子通道：衰减快，条件脉冲20 ms宽      L型Ca 2+离子通道：衰减缓慢，条件脉冲的宽度十几秒•条件脉冲与测试脉冲的间隔不能设定得过长，以防止失活的通道恢复，影响测试脉冲的测量全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析条件脉冲测试脉冲71Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 概念概念量效曲线：X轴——药物剂量/浓度大小Y轴——药理效应强弱•阈浓度•半效浓度EC50•最大效能•效价强度全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析五、五、量效曲线量效曲线72Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit中的中的Hill方程：方程：Hill (4 parameter logistic)方程方程（1）观察药物对某种受体/通道电流的诱发/增强作用时：Imax：药物作用后通道的最大电流幅度Imin：药物作用前的电流幅度C50：半效浓度EC50[X]：所施加的药物浓度h：Hill系数设通道电流的幅度为I，将Y轴设为I/Imax，拟合时，设Imax=1若观察配体对受体通道诱发电流的情况，则拟合后，Imin接近0。

全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析l Clampfit中的中的Hill方程：方程：Hill (4 parameter logistic)方程方程（1）观察药物对某种受体/通道电流的诱发/增强作用时：Imax：药物作用后通道的最大电流幅度Imin：药物作用前的电流幅度C50：半效浓度EC50[X]：所施加的药物浓度h：Hill系数设通道电流的幅度为I，将Y轴设为I/Imax，拟合时，设Imax=1若观察配体对受体通道诱发电流的情况，则拟合后，Imin接近073Patch clamp training classApr. 23-25, 2014（2）观察药物对某种受体/通道电流的阻断作用时：Imax：最大浓度药物作用后的电流幅度Imin：药物作用前的电流幅度C50：半抑制浓度IC50[X]：所施加的药物浓度h：Hill系数设通道电流的幅度为I，将Y轴设为I/Imin拟合时，设Imin=1若药物对通道电流完全阻断，拟合后，Imax接近0全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析74Patch clamp training classApr. 23-25, 2014（3）观察配体诱发受体通道的电流时，因配体施加前通道不开放，可以采用Clampfit中的Hill, Langmuir方程对量效曲线进行拟合：设：i=1C=0C50：半效浓度EC50[X]：所施加的药物浓度h：Hill系数全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析75Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 例例1. GABA诱发的诱发的GABA-A受体电流的量效曲线制作受体电流的量效曲线制作全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析GABA : 0.5、、1、、5、、10、、50、、100 μmol/L76Patch clamp training classApr. 23-25, 2014全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析l Clampfit演示演示GABA电流的量效曲线电流的量效曲线77Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 例例2. 荷包牡丹碱荷包牡丹碱Bicuculline对对GABA-A受体电流抑制作用的量效曲线制作受体电流抑制作用的量效曲线制作全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析Bicuculline:0, 0.1, 1, 10, 100 μmol/LGABA : 10 μmol/L78Patch clamp training classApr. 23-25, 2014全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析l Clampfit演示演示Bicuculline的量效曲线的量效曲线79Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l 几点说明几点说明Ø药物浓度的选择：（1）要含有阈浓度和最大效能浓度。

2）按一定倍比关系：如1、2、5、10、20、50、100等3）至少4个浓度全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析80Patch clamp training classApr. 23-25, 2014Ø药物施加原则：（1）按照从低到高浓度的顺序施加在用浴槽灌流给药时要将前次药物冲洗掉，然后再给下一个浓度；在用培养皿时（难以灌流）每次施加的药量要少，防药物累加2）为获得稳定的量效曲线，药物从低到高的几个浓度最好在同一个细胞上施加因此要求有合适的给药装置和高质稳定的全细胞记录3）正式实验前，需要先期做预实验来确定每个药物浓度的给药间隔时间，确保药物作用不受受体失敏的影响全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析81Patch clamp training classApr. 23-25, 2014Ø依据实验要求和药物特点选择给药方法：（1）配体或通道的激动剂的施加要求快速、微量的给药装置；（2）昂贵的药物一般不采用灌流给药，而采用压力喷射给药；（3）受体拮抗剂可与配体一起施加，也可预先加入拮抗剂；（4）用培养皿时，因灌流置换液体困难，要采用压力喷射给药方法；（5）直接用加样枪向培养皿或浴槽内滴加药物的方法，只用于简单的药物定性；（6）离子电泳的给药方法适合于能够离子化的药物。

全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析82Patch clamp training classApr. 23-25, 2014ØClampfit的作图效果不理想，不适合正式发表文章采用作图软件Origin制作量效曲线：•选择Analysis/Non-linear Curve Fit中的Logistic方程全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析83Patch clamp training classApr. 23-25, 2014Ø实验一般要求有细胞的个数（n），获得平均值和标准差•   标准差可用作图软件Origin显示出来：在数据表窗口，选择Column/Set as Y Error全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析84Patch clamp training classApr. 23-25, 2014Ø不同药物量效曲线的比较要求：•选择相同的浓度•兼顾阈浓度与最大效能浓度•将两个量效曲线作在一起的方法：    Clampfit——在制作第2个量效曲线时选择Analyze/Append to Graph功能来制作    Origin——采用在数据表直接输入数据的方法将几条量效曲线作在一个图中。

•以某药物最大诱发电流来标化其他药物例子：        Nic诱发最大电流=100%        ACh诱发电流与之比较全细胞记录全细胞记录数据的数据的分析分析85Patch clamp training classApr. 23-25, 2014单通道记录数据的分析单通道记录数据的分析一、一、单通道电导的测算单通道电导的测算二、二、单通道开放概率的分析单通道开放概率的分析三、三、多通道开放概率的分析多通道开放概率的分析四、四、单通道单通道I-VI-V曲线曲线五、单通道开放时间分布的直方图五、单通道开放时间分布的直方图86Patch clamp training classApr. 23-25, 2014单通道记录数据的分析单通道记录数据的分析l 单通道电导单通道电导概念概念单通道电导（G）指通道完全开放（Full opening）时，流经单通道的电流（i）与通道两侧电压差（钳制电位与通道反转电位的差值ΔV）的比值，即：G＝i /ΔV电导的单位是西门子（Siemens, S），一般通道电导多为pS级，少数通道电导较大，可达nS级（1 nS＝1 pA/mV）一、单通道电导的测算一、单通道电导的测算i(pA)ΔV(mV)87Patch clamp training classApr. 23-25, 2014单通道记录数据的分析单通道记录数据的分析l 亚开放状态（亚开放状态（Substate））Ø不完全开放状态，电流幅度小。

•    NMDA受体：两个开放状态（50 pS主开放、40 pS亚开放）•    人工纯化通道蛋白突变体：常有亚开放状态UnitarycurrentClosingDwell timeOpeningDwell timeSubstate*****88Patch clamp training classApr. 23-25, 2014单通道记录数据的分析单通道记录数据的分析l闪烁现象（闪烁现象（Flicking））Ø通道的高速开放与关闭导致通道开放或关闭持续时间太短的现象Ø包括：（1）通道高速短时开放；（2）通道在开放时高速短时关闭89Patch clamp training classApr. 23-25, 2014单通道记录数据的分析单通道记录数据的分析l 单通道电导的测算方法单通道电导的测算方法（1）简单粗略的方法：找到基线，观测单通道电流幅度峰值，并除以膜片两侧的电压差与反转电位的差值，就得到单通道电导G例：膜两侧电压差（钳制电位）Vm=30 mV反转电位Vrev=0 mV测得电流幅度i=100 pA则单通道电导G=100 pA/(30-0) mV=3.33 nS该方法相对粗糙，但可快速观察电导的大致变化。

90Patch clamp training classApr. 23-25, 2014单通道记录数据的分析单通道记录数据的分析（2）斜率电导(Slope conductance)：通过单通道I-V曲线求得（见后）91Patch clamp training classApr. 23-25, 2014单通道记录数据的分析单通道记录数据的分析（3）直方图拟合法：拟合电流幅度分布，计算出单通道平均电导            高斯（Gaussian）方程对单通道电流幅度直方图进行拟合            Clampfit中的高斯方程：横轴x：电流幅度的bin值纵轴f(x)：检测的事件数目μ：单通道电流幅度的平均值σ：单通道电流幅度的标准差A、C：系数i＝1时，一极高斯方程 G ＝μ /ΔV92Patch clamp training classApr. 23-25, 2014单通道记录数据的分析单通道记录数据的分析l Clampfit演示用演示用Histogram功能和高斯拟合测算单通道电导功能和高斯拟合测算单通道电导93Patch clamp training classApr. 23-25, 2014单通道记录数据的分析单通道记录数据的分析l 注意事项注意事项Ø如果通道开放概率太低（只有很少的几个开放事件），则拟合会失真，此时需要延长采样记录时间以获得更多的开放事件。

Ø测算单通道电导时应选择单通道开放的峰值（Level 1的峰值）Ø亚开放状态多时，会在单通道电流幅度峰值与基线峰值之间形成亚开放状态的峰值，据此可测算出亚开放电导Ø闪烁现象多会使单通道电流幅度曲线峰值的左右不对称，影响电导的测算升高检测事件的阈值或限制事件持续时间，可去除闪烁现象Ø如果记录的数据中都是闪烁现象，没有完全开放事件，则无法测算电导在人工质膜实验中，这种情况多表明通道蛋白纯化过程有问题Ø无论上述哪种方法，都需要先确定正确的基线，并对膜片漏电流进行去除，同时还要有一定的例数（膜片数）要求94Patch clamp training classApr. 23-25, 2014单通道记录数据的分析单通道记录数据的分析二、单通道开放概率的分析二、单通道开放概率的分析分析开放概率之前，要先对开放事件进行检测l单通道事件的检测单通道事件的检测（1）事件检测前的准备工作            基线调零、坏点去除、滤波等2）对检测参数进行设定（右图）（3）进行事件检测95Patch clamp training classApr. 23-25, 2014单通道记录数据的分析单通道记录数据的分析l Clampfit演示单通道开放事件的检测演示单通道开放事件的检测96Patch clamp training classApr. 23-25, 2014单通道记录数据的分析单通道记录数据的分析l 单通道开放概率分析实例单通道开放概率分析实例以机械敏感性MscL通道为例，单通道开放概率Po的计算过程如下：（1）打开单通道数据文件，进行数据处理（2）进行事件检测（3）计算Po（4）作压力-单通道开放概率关系曲线（5）对压力-单通道开放概率关系曲线进行拟合Pressure-Po关系曲线关系曲线97Patch clamp training classApr. 23-25, 2014单通道记录数据的分析单通道记录数据的分析l Clampfit中的拟合方程：Boltzmann, charge-voltage设：f(V)=Po，单通道开放概率Vc=1/α，通道对负压的敏感度（mmHg），拟合获得的重要指标V=P，施加的负压值Vmid= P1/2，通道50%开放时的压力值，拟合获得的重要指标Imax=1，以通道100%开放为1C=0，Po的位移设为0则上述方程可以写成右侧的Boltzmann方程：98Patch clamp training classApr. 23-25, 2014单通道记录数据的分析单通道记录数据的分析l Clampfit演示单通道开放概率演示单通道开放概率Po的计算的计算99Patch clamp training classApr. 23-25, 2014单通道记录数据的分析单通道记录数据的分析l 注意：注意：单通道概率分析的前提是：能观察到膜片上全部通道开放的情况，进而知道膜片上通道的最大数目。

100Patch clamp training classApr. 23-25, 2014单通道记录数据的分析单通道记录数据的分析三、多通道开放概率三、多通道开放概率l NPo的概念的概念Ø膜片上通道没有全部开放，通道总数N未知，Po无法计算，只能计算NPo——多通道开放概率Ø单通道开放概率Po=NPo/NØ压力—Npo曲线用Boltzmann方程拟合101Patch clamp training classApr. 23-25, 2014单通道记录数据的分析单通道记录数据的分析l 拟合拟合压力压力—NPo曲线的曲线的Boltzmann方程：方程：    NPo：多通道开放概率NPomax：观察到的所有开启通道的最大开放概率 = 观察到的通道数α：其倒数为通道对负压的敏感度（mmHg）P：施加的负压值P1/2：通道50%开放时的压力值    拟合后，获得P1/2和1/α102Patch clamp training classApr. 23-25, 2014单通道记录数据的分析单通道记录数据的分析l 不同组不同组NPo的比较的比较Ø不同膜片NPo的平均•不同膜片通道数不同，NPo和NPomax都不会相同。

•求NPo / NPomax（NPomax：给药前后两次记录中最大的NPo）Ø不同组比较方法：以压力-NPo曲线为例    （1）获得一个膜片给药前后不同负压条件下的NPo，求出 NPo / NPomax    （2）求出所有膜片上的 NPo / NPomax，得到药物施加前、后的两条压力-NPo曲线    （3）对曲线进行Boltzmann拟合，比较两组的P1/2和1/α103Patch clamp training classApr. 23-25, 2014单通道记录数据的分析单通道记录数据的分析l 例子例子Ø钳制电位 = 10 mV，施加压力 = -68 mmHg，获得NPocontrol，然后给予糜蛋白酶(Chymotrypsin,300 μg/ml)，获得NPochymotrypsinØ本例NPomax=4求出该膜片的NPocontrol / NPomax和（NPochymotrypsin / NPomax）Ø求出不同膜片上的NPocontrol / NPomax和NPochymotrypsin / NPomax，进行统计学处理Vm=-10 mVPressure= 0 mmHg4321Level104Patch clamp training classApr. 23-25, 2014单通道记录数据的分析单通道记录数据的分析l 单通道单通道I-V曲线的曲线的概念与概念与意义意义Ø通单道电流I大小与膜片两侧电压差大小（钳制电位Vm）之间的关系曲线。

X轴：膜钳制电位Vm（mV）Y轴：单通道电流I（pA）Ø意义：•反转电位（Vrev）、斜率电导（Gs）•药物会影响通道性质，改变I-V曲线的形状和位置四、单通道四、单通道I-VI-V曲线曲线I(pA)Vm(mV)105Patch clamp training classApr. 23-25, 2014单通道记录数据的分析单通道记录数据的分析l I-V曲线的制作曲线的制作Ø在Clampex中获得不同歩阶电压（Vm）下通道电流I，保存为数据文件（.abf）Ø在Clampfit中打开该文件，开始制作I-V曲线：（1）对数据基线调零、坏点去除、滤波2）用Histogram功能和高斯拟合测算每个Sweep的单通道平均电流值I3）将平均电流值I与相应的歩阶电压Vm输入到Results窗口空白表格中4）用Create Graph作图5）作回归曲线：选择“Straight line, standard ”作为回归方程6）拟合结果：斜率电导mStraight line, standard方程：单通道单通道 I-V曲线的制作曲线的制作A, 显示膜片在不同歩阶电压下通道电流的变化. 膜片两侧液体相同.B, I-V曲线，反转电位为0 mV，回归后单通道斜率电导Gs = 3.34 nS.数据来自脂质体上构建的细菌机械敏感性MscL通道，施加的负压稳定在-70 mmHg.106Patch clamp training classApr. 23-25, 2014单通道记录数据的分析单通道记录数据的分析A100 pA250 ms＋60 mV＋50 mV＋40 mV＋30 mV＋20 mV＋10 mV0 mV－10 mV－20 mV－30 mV－40 mV－50 mV－60 mVBG＝3.34 nS(pA)(mV)107Patch clamp training classApr. 23-25, 2014单通道记录数据的分析单通道记录数据的分析l 注意如下几点：注意如下几点：Ø如果膜片上含有不止 1 个通道，且通道的开放概率太高，没有单个通道开放的情况出现，则无法进行回归。

解决办法：        （1）如果标本是人工质膜，应降低通道蛋白嵌入量，进而降低膜片上通道数目；        （2）如果观察的是配体门控性离子通道，应该降低配体的使用浓度108Patch clamp training classApr. 23-25, 2014单通道记录数据的分析单通道记录数据的分析Ø   避免亚开放事件、闪烁事件被计入内Ø测量多个膜片，获得样本量n，求出平均的I-V曲线      由于膜片上单通道电流幅度的大小不受细胞大小的影响，故不用标化即可进行平均  109Patch clamp training classApr. 23-25, 2014单通道记录数据的分析单通道记录数据的分析Ø单通道开放时间的分析首先要作出通道开放时间的事件频数直方图，然后选择合适的指数方程对其拟合，求出开放时间分布的时间常数τ值（平均开放持续时间）五、单通道开放时间分布的直方图五、单通道开放时间分布的直方图110Patch clamp training classApr. 23-25, 2014单通道记录数据的分析单通道记录数据的分析Ø普通直方图X轴：通道开放时间Dwell time(ms)，bin值Y轴：检测的事件数目，可写成：Event NumberCount NumberEvents/BinEvents/x msØ对数直方图——可见通道较快速的时间常数X轴：Log dwell time(ms)，bin值Y轴：事件数目的平方根。

可写成：Square root count（N）Frequency（Square root scale）Events（Square root）/binSquare root of events/binDwell Time (ms)Events / 2 msSquare root events / (60/Decade)Log Dwell Time (ms)111Patch clamp training classApr. 23-25, 2014单通道记录数据的分析单通道记录数据的分析l 单通道开放时间分布的直方图制作及拟合单通道开放时间分布的直方图制作及拟合（1）单通道事件的检测（2）用Fast Graph功能制作单通道开放时间分布的直方图（3）Clampfit拟合方程：Exponential, log probability   τ为单通道平均开放时间4）Analyze/Fitting Results拟合结果：单通道平均开放时间τ值112Patch clamp training classApr. 23-25, 2014单通道记录数据的分析单通道记录数据的分析l Clampfit演示单通道开放时间分布的直方图制作演示单通道开放时间分布的直方图制作113Patch clamp training classApr. 23-25, 2014单通道记录数据的分析单通道记录数据的分析l 几点说明几点说明（1）拟合的曲线呈偏斜的钟形，曲线峰值为τ。

2）若存在多个峰值，表明通道开关时间具有多个状态，此时应该采用多指数形式拟合，获得多个τ值3）设α和β分别为开放与关闭的速率常数，则：α＝1/τo（τo为开放时间分布的时间常数）β＝1/τc（τc为关闭时间分布的时间常数）（4）药物或不同钳制电位等因素可能会影响开放速率Square root events / (60/Decade)Log Dwell Time (ms)114Patch clamp training classApr. 23-25, 2014突触放电活动突触放电活动数据的数据的分析分析一、一、突触自发活动的特点突触自发活动的特点二、二、突触电流的检测突触电流的检测三、三、突触电流的分析突触电流的分析115Patch clamp training classApr. 23-25, 2014突触放电活动突触放电活动数据的数据的分析分析一、突触自发活动的特点一、突触自发活动的特点l 兴奋性突触活动兴奋性突触活动（1）微小兴奋性突触后电流（mEPSC）：突触前膜Glu随机量子释放引起的突触后膜反应            •频率增高：Glu随机量子释放频率增加•幅度增高：Glu量子同时释放数目增加•不受TTX影响116Patch clamp training classApr. 23-25, 2014突触放电活动突触放电活动数据的数据的分析分析（2）自发兴奋性突触后电流（sEPSC）：突触前膜由自发AP诱发的Glu释放引起的突触后膜反应。

•频率增高：Glu量子释放数目增加•幅度增高：a)同一时刻突触前递质释放总量增加b)突触后膜受体反应性增高和/或受体数目增多•TTX完全抑制117Patch clamp training classApr. 23-25, 2014突触放电活动突触放电活动数据的数据的分析分析400 pA250 ms（3）自发动作电流（Spontaneous action current, sAC）：由突触前膜自发动作电位诱发的Glu量子释放达到较大数量时，突触后膜在产生的sEPSC基础上就引发了sAC，可被TTX完全抑制118Patch clamp training classApr. 23-25, 2014突触放电活动突触放电活动数据的数据的分析分析l 抑制性突触活动抑制性突触活动（1）微小抑制性突触后电流（mIPSC）（2）自发抑制性突触后电流（sIPSC）•产生机制：分别与mEPSC 和sEPSC一致•mIPSC不受TTX影响，sIPSC被TTX阻断•由GABA介导250 ms100 pA119Patch clamp training classApr. 23-25, 2014突触放电活动突触放电活动数据的数据的分析分析二、突触电流的检测二、突触电流的检测l 突触电流检测模板的创建突触电流检测模板的创建（1）打开数据文件进行数据处理（2）打开Event Detection/Create Template设定框（3）寻找作为模板的突触电流（4）确定作为模板的突触电流：Add，Find next after add（5）持续寻找并确定作为模板的突触电流，直到电流的形状满意为止：            Align，Next，Undo，Clear，（6）将最终确定的模板保存为*.atf文件：自动保存在SearchParams文件夹。

Clampfit演示模板的创立）演示模板的创立）120Patch clamp training classApr. 23-25, 2014突触放电活动突触放电活动数据的数据的分析分析l 突触电流的检测突触电流的检测（1）Category•多模板•电流方向•Allow multiple categories per event（2）Template：选择所创建的合适模板•Variable amplitude template•In template•Bring marker•Template match threshold（3）Fitting•Product of exponentials•Sum of exponentials（4）Calculate taus from [ ]% of peak（5）Search Region（（Clampfit演示突触电流的检测）演示突触电流的检测）121Patch clamp training classApr. 23-25, 2014突触放电活动突触放电活动数据的数据的分析分析三、突触电流的分析三、突触电流的分析l突触电流发放频率的分析突触电流发放频率的分析（1）突触电流发放频率的获得•一个category：从Event Statistics信息框中找到Instantaneous frequency。

•多个category：Events数据表中对Inst. Freq.栏，用Analyze/Basic Statistics进行统计分析，结果在Basic Stats数据表（平均值、标准差等）Clampfit演示发放频率的获得）演示发放频率的获得）122Patch clamp training classApr. 23-25, 2014突触放电活动突触放电活动数据的数据的分析分析（2）作电流发放频率直方图    X轴：Events数据表              Event Start Time  Y轴：突触电流发放个数（默认）123Patch clamp training classApr. 23-25, 2014突触放电活动突触放电活动数据的数据的分析分析（3）统计检验Ø统计检验时最好采用自身对照，对频率进行标化（对照区段的发放频率为1）Ø对于一些无法进行自身对照的实验，实验需尽可能维持条件稳定，同时增大实验例数，这样才能保证统计检验的可靠性Ø将实验数据保存在Results窗口空闲数据表中，采用：Student’s t检验：用于两组数据的比较方差分析：用于两组以上数据的比较Ø检验结果在System Lab Book中。

 124Apr. 23-25, 2014突触放电活动突触放电活动数据的数据的分析分析【Analyze/F-Test and Student’s t-Test进行t检验】ØF-Test：进行方差齐性检验•方差不齐：两组方差差异显著（P＜0.05），Unpaired (separate variance)•方差齐：两组方差差异无显著性（p＞0.05），Unpaired (pooled variance)   Correlated paired groupsØStudent’s t-Test：P ＜ 0.01或0.05，说明两组数据的差异具有显著统计学意义 Patch clamp training classApr. 23-25, 2014125Apr. 23-25, 2014突触放电活动突触放电活动数据的数据的分析分析【Analyze/Analysis of Variance进行方差分析】ØMethod：单因素（One-way ANOVA）、双因素（Two-way ANOVA）ØSelect Column：选择要进行比较的几个Column的数据ØRow Range：选Full Column。

不勾Perform Breakdown AnalysisØP ＜ 0.01或0.05，说明组间数据有差异Ø多重比较（如SNK、Tukey法——Clampfit软件中没有提供，可采用统计学专用软件如SAS）Patch clamp training classApr. 23-25, 2014126Apr. 23-25, 2014突触放电活动突触放电活动数据的数据的分析分析Patch clamp training classApr. 23-25, 2014l Clampfit演示演示t-Test和和ANOVA过程过程127Patch clamp training classApr. 23-25, 2014突触放电活动突触放电活动数据的数据的分析分析l突触电流幅度的分析突触电流幅度的分析（1） Kolmogorov -Smirnov（K-S）检验Ø非参数统计方法：当进行两组或多组K-S检验时，只考察这两组函数之间的差别而不考虑函数的分布特征，据此判断它们是否属于同一个函数分布Ø累积概率分布图（Cumulative probability distribution）X：电流幅度（Events数据表中Peak Amp栏）Y：突触电流发放个数的累积，并用最大值标化FN1 (X)和FN2 (X)分别为两组突触电流相对累积频率分布DCumulative frequencyX (Bin)FN1 (X)FN2 (X)128Patch clamp training classApr. 23-25, 2014突触放电活动突触放电活动数据的数据的分析分析（2）累积概率分布图的制作及K-S检验步骤Ø将突触电流幅度值X1，X2，…，Xn由小到大排序，对应的突触电流频率数FN (X1)， FN (X2) ，…，FN (Xn)也随之排序。

Ø依次将排序后的突触电流频率数进行累加，并以最后的累加值为1，将频率数转换成相对累积频率X轴：电流幅度，Y轴：相对累积频率，作出累积概率（频率）分布图Ø依次求出两组突触电流相对累积频率之差，找出最大差值D，即K-S统计变量Ø根据D，可求出两组突触电流数据属于同一分布的概率P， P ＜ 0.05，表明两组的差异有显著性意义129Patch clamp training classApr. 23-25, 2014突触放电活动突触放电活动数据的数据的分析分析l Clampfit演示演示累积累积概率概率分布图分布图的制作及的制作及K-S检验检验（完）（完）130Patch clamp training classApr. 23-25, 2014附附1 1：统计学基础知识：统计学基础知识l数据资料类型数据资料类型131Patch clamp training classApr. 23-25, 2014附附1 1：统计学基础知识：统计学基础知识l常见的统计表常见的统计表——三线表的要求三线表的要求    （1）标题：表要有序号，表中数据的含义要清晰    （2）数字和符号：小数点位置对齐，暂缺或未记录用“...”无数字用“—”数字为零用“0”。

    （3）表的备注：非必需，需要特别说明时写在表底线下方132Patch clamp training classApr. 23-25, 2014附附1 1：统计学基础知识：统计学基础知识l定量资料统计分析定量资料统计分析Ø t 检验:（Student t 分布）•单组设计资料的 t 检验•配对设计资料的 t  检验•成组设计资料的 t 检验Ø方差分析：•单因素设计资料的方差分析•配伍组设计资料的方差分析•交叉设计资料的方差分析•析因设计资料的方差分析•具有重复测量资料的方差分析•正交试验设计资料的方差分析133Patch clamp training classApr. 23-25, 2014附附1 1：统计学基础知识：统计学基础知识lt检验与方差分析的比较134Patch clamp training classApr. 23-25, 2014附附1 1：统计学基础知识：统计学基础知识l单因素多水平设计资料的方差分析135Patch clamp training classApr. 23-25, 2014附附1 1：统计学基础知识：统计学基础知识l析因设计资料的方差分析（2X4设计）(0.025mmol/L)136Patch clamp training classApr. 23-25, 2014附附1 1：统计学基础知识：统计学基础知识l具有一个重复测量的两因素设计资料137Patch clamp training classApr. 23-25, 2014附附1 1：统计学基础知识：统计学基础知识l定性资料统计分析定性资料统计分析138Patch clamp training classApr. 23-25, 2014附附1 1：统计学基础知识：统计学基础知识l一般Χ2检验与Fisher精确检验——四格表139Patch clamp training classApr. 23-25, 2014附附2 2：：《《实用膜片钳技术实用膜片钳技术》》勘误表勘误表。