
分子生物学常用实验技术及方法.doc
14页第二章 常用实验技术及方法一、聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)反应总体积为50 µl,其中含有:模板DNA 0.5 µlPCR缓冲液(不含MgCl2) 5 µl10×MgCl2 溶液 5 µldNTP (2.5 mmol/L) 0.5 µl引物1 (50 umol/L) 0.5 µl引物2 (50 umol/L) 0.5 µlTaq DNA 聚合酶 0.5 µl无菌去离子水加至 50 µl上层用25 µl 液体石蜡油覆盖循环参数为: 94 ℃变性10 min94 ℃变性1 min56 ℃退火1 min72 ℃延伸2 min共30个循取环,PCR结束后,取2 µl PCR扩增产物,经1 %琼脂糖凝胶电泳,在紫外检测仪上观察并拍照二、基于PCR技术的定点突变1. 根据所要突变位点的特定氨基酸,并按公认的四引物法原理,分别设计上下游引物Primer 3和Primer 4,这两条引物部分交错互补,但分别含有欲突变后的碱基(红点)的互补序列(如下图所示);P1P2P4P32. 用基因5’端的Primer 1和Primer 2 PCR扩增DNA片段1,用基因3’端的Primer4和Primer 3一起PCR扩增DNA片段2,PCR反应条件基本如上(七、聚合酶链反应),可根据具体实验略有调整,反应完毕后,分别电泳回收DNA片段1和DNA片段2;3. 以片段1和片段2为模板,进行第二次PCR反应,反应体系为50 µl:片段1 1 µl片段2 1 µl10×PCR缓冲液(不含MgCl2) 5 µl10×MgCl2溶液 5 µldNTP (2.5 mmol/L) 5 µlTaq酶 1 µl加ddH2O至 50 µl在该反应体系中先不加入引物,按上述反应条件进行10个循环,然后再加入Primer 1和Primer 4各1 ul,按上述反应条件再扩增30个循环;4. PCR产物经电泳检查,然后连接到相应的载体中,进行测序以确定定点突变的正确性。
三、Total RNA的提取 (Catrimox-14TM RNA Isolation Kit Ver. 2.11) 1. 吸弃培养细胞中的旧培养基,用PBS洗涤1-2次后,加入1 ml的Catrimox-14TM溶液,然后充分混匀;2. 收集细胞裂解液,按以下条件进行离心:细胞数<5×105 : 9500 rpm (约5 000×g) 5 min 细胞数5×105 - 1×107 :3000 rpm (约450×g) 5 min 细胞数>1×107 : 1500 rpm (约112.5×g) 5 min 3. 除去上层溶液,加入1 ml的DEPC处理的H2O,上下颠倒混合数次后, 12000 rpm离心2 min;4. 吸弃上层溶液,激烈振荡使沉淀松动;5. 向Microtube中加入1 ml的2 M LiCl溶液;6. 激烈振荡后,室温下12000 rpm离心5 min,除去溶液;7. 沉淀用70 %冷乙醇清洗一次;8. 沉淀经过简单的真空干燥后,溶于适当的缓冲液中四、RT-PCR (TaKaRa One Step RNA PCR Kit) 1. 按Takara Kit 中所提供的标准步骤配制PCR 体系;2. 按以下条件进行RT-PCR 反应 (1) 50 ℃ 30 min (2) 94 ℃ 2 min (3) 94 ℃ 1 min (4) 56 ℃ 1 min (5) 72 ℃ 2 min 3. 重复步骤(3)-(4)-(5),共30个循环; 4. 反应结束后,取3-5 µl进行琼脂糖凝胶电泳检测,并将PCR产物冷冻保存。
五、DNA 样品的琼脂糖凝胶电泳50×TAE: 242 g Tris 碱57.1 ml 冰乙酸 100 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0)1. 称取0.5 g agarose,置于250 ml 锥形瓶中,加入50 ml 1×TAE(含EB 0.5 ug/ml),加热使其全部溶解;2. 封口、安放梳子;3. 待凝胶稍凉后铺板;4. 胶凝固后,放入电泳槽中,倒入1×TAE,淹没胶面,拔去梳子;5. 将DNA 样品与6×的上样缓冲液混合,加于加样孔中;6. 80-100V 恒压电泳,待溴酚蓝走至凝胶适当位置时,停止电泳,紫外灯下观察或拍照六、从琼脂糖凝胶上回收DNA 片段(Vitagene DNA 片段回收Kit)1. 用一灭菌刀片割下含目的DNA 片段的琼脂糖凝胶块,放入Eppendorf管中;2. 用Vitagene DNA 片段回收Kit,并按照试剂盒提供的步骤回收所要的DNA片段七、DNA 片段的连接反应1. 总体系为10-20 µl,外源DNA插入片段和载体片段按一定摩尔比混合;2. 加入1-2 ul 10×Buffer,2 ul T4DNA连接酶,混匀;3. 12-16 ℃反应过夜。
八、大肠杆菌感受态细胞的制备1. 挑取单菌落接种于3-5 ml LB 液体培养基中,37 ℃振荡培养过夜;2. 取0.5 ml培养物转接种于50 ml LB 液体培养基中,37 ℃振荡培养约3 h至对数生长期(OD600 = 0.4-0.6);3. 将细菌转移至50 ml 离心管中,冰浴20 min;4. 于4℃,4200 rpm 离心10 min,弃上清;5. 用5 ml 冰预冷的0.1 M CaCl2悬浮菌体,冰浴30 min;6. 于4 ℃,4200 rpm 离心10 min,弃上清;7. 用3 ml 0.1 M CaCl2/15%甘油悬浮菌体(动作要轻),每管分装100 µl,立即使用或置于-70 ℃冰箱保存九、大肠杆菌感受态细胞的转化1. 感受态细胞若保存于-70 ℃冰箱,取出后先在冰上复苏5-10 min;2. 加入适量DNA 样品,混匀,冰浴30 min;3. 42 ℃水浴1 min,立即放入冰上冷却2 min;4. 加入0.5 ml LB 液体培养基, 37 ℃振荡培养45 min;5. 取适量转化的菌体,涂布于含抗生素的LB 平板上,等平板表面的液体被吸收后,倒置放入37 ℃温箱,培养过夜。
十、大肠杆菌质粒DNA 的小规模制备(一)、材料:1. Solution I 葡萄糖 50 mMTris-HCl (pH8.0) 25 mMEDTA (pH8.0) 10 mM2. Solution II NaOH 0.2 MSDS 1%3. Solution III 5 M 乙酸钾 60 ml冰乙酸 11.5 ml去离子水 28.5 ml4. TE Buffer (pH8.0) Tris-HCl (pH8.0) 10 mMEDTA (pH8.0) 1 mM(二)、方法:1. 在2 ml含相应抗生素的LB液体培养基中接种单菌落,37 ℃剧烈振摇培养过夜;2. 取细菌培养物置于Eppendorf管中,13000 rpm离心30 sec,弃上清;3. 用100 µl SolutionⅠ重悬菌体沉淀,冰浴2-3 min;4. 加200 µl新鲜配制的SolutionⅡ,颠倒Epp管数次以充分混匀,室温放置2 min;5. 加150 µl用冰预冷的Solution Ⅲ,温和振荡数次,冰浴3-5 min;6. 13000 rpm离心5 min,将上清转移至一新Epp管中;7. 加等体积异丙醇振荡混匀,室温5 min;8. 13000 rpm离心5 min,弃上清,并用200 ul去离子水溶解沉淀;9. 加100 ul 7.5 M (NH4)2Ac混匀,冰浴5 min; 10. 13000 rpm离心2 min;11. 转移上清至一新Epp管;12. 加2倍体积的乙醇,振荡混匀,于室温放置5 min,13000 rpm离心5 min;13. 用1 ml 70 %乙醇洗涤双链DNA沉淀,13000 rpm离心5 min,弃上清,在空气中使核酸沉淀干燥10分钟;14. 用20 µl TE buffer重新溶解核酸沉淀,贮存于-20 ℃备用。
十一、蛋白质诱导表达(一)、材料1. 氨苄青霉素(用去离子水配成60 mg/ml,用0.22 µm 滤器过滤除菌,-20 ℃避光保存)2. IPTG(用去离子水配成200 mM,用0.22 µm 滤器过滤除菌,-20 ℃保存)3. PMSF(用异丙醇配成10 mM,-20 ℃保存)(二)、方法1. 挑取单克隆接种于含有氨苄青霉素(100 µg/ml)的小量LB 培养液中,37 ℃振荡培养过夜;2. 将过夜培养物按1∶100 的比例接种到含氨苄青霉素(100 µg/ml)的LB 液体培养基中,37 ℃振荡培养至OD600约为0.5;3. 加入IPTG 至终浓度为0.1-1 mM,每隔一小时取一次样;4. 在诱导了3 小时的菌液中取适量(如10 ml),离心,去上清,加入1ml PBS 重悬,再加入PMSF 至终浓度为0.1 M,冰上预冷10 min;5. 进行超声破碎10 min(10-20 sec /次),至菌液较为澄清,离心,取上清;6. 用相同体积的PBS 重悬沉淀,将诱导前及诱导后所取的样品,以及超声破碎后的上清和沉淀分别进行蛋白电泳检测,染色、脱色;7. 根据脱色结果,可确定是否有表达出目的蛋白,选择合适的诱导时间以及表达量较高的克隆,并且判断所表达的蛋白是可溶性的还是以包涵体形式存在。
十二、GST 融合蛋白的表达和纯化1. 按上述蛋白质诱导表达的方法表达出GST 融合蛋白,此时GST 融合蛋白是溶于PBS 中的;2. 取适量Glutathione SepharoseTM 4B beads(Amersham Biosciences,Sweden),用PBS 洗3 遍;3. 将beads 加入GST 融合蛋白的上清液中,4℃ Rotation 4-6 h;4. 4℃最高速离心3-5 sec,小心吸弃上清;并用PBS 洗3 遍;5. 藕联了GST 融合蛋白的beads 备用于后面的实验十三、蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(一)、材料1. 30%丙烯酰胺储存液: 丙烯酰胺 29.2 g亚甲双丙烯酰胺 0.8 g加蒸馏水溶解后。
