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临床免疫学和免疫检验沉淀反应讲义.doc

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    • 第六章沉淀反应沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在特定条件下发生特异性结合时出现的沉淀现象 第一节沉淀反应的特点沉淀反应中的抗原多为蛋白质、多糖、血清、毒素等可溶性物质沉淀反应分两个阶段,第一阶段为抗原抗体发生特异性结合,几秒到几十秒即可完成,出现可溶性小的复合物,肉眼不可见; 第二阶段为形成可见的免疫复合物,约需几十分钟到数小时才能完成,如沉淀线、沉淀环第二节液体内沉淀试验一、絮状沉淀试验受抗原和抗体比例的直接影响抗原抗体溶液在电解质的存在下结合,形成絮状沉淀物,这种絮状沉淀 因此常用来作为测定抗原抗体反应最适比例的方法,常见类型有:(一) 抗原稀释法(二) 抗体稀释法(三) 方阵滴定法抗原进行一系列稀释与恒定浓度抗血清反应 抗体进行一系列稀释与恒定浓度抗原反应 方阵滴定法即棋盘滴定法二、免疫浊度测定属于液体内沉淀反应,其特点是将现代光学测量仪器与自动化检测系统相结合应用于沉淀反应,可进 行液体中微量抗原、抗体及小分子半抗原定量检测一)免疫比浊测定的影响因素1. 抗原抗体的比例 是浊度形成的关键因素当抗原过量时,形成的IC分子小,而且会发生再解离,使浊度反而下降,光散射亦减少,这就是 高剂量钩状效应。

      当抗体过量时,IC的形成随着抗原递增而增加,至抗原、抗体最适比例处达最高峰,这就是 经典的海德堡曲线理论在反应体系中保持抗体适当过量,如形成抗原过量则造成测定的准确性降低2. 抗体的质量 对免疫比浊测定法的抗体要求(1) 特异性强(2) 效价高(3) 亲和力强:则抗体的活性高,不仅可以加快抗原抗体反应的速度,而且形成的 IC较牢固,不易 发生解离在速率比浊法中尤为重要4) R型和H型抗体:根据抗血清来源的动物种类不同,分为 R型抗体和H型抗体R型抗体是指以家兔为代表的小型动物 被注射抗原免疫后制备的抗血清 这类抗血清的特点是 亲和力较强,抗原抗体结合后不易发生解离 H型抗体是指以 马为代表的大型动物 注射抗原后制备的抗血清, 这类抗血清的 亲和力弱,抗原抗体结合 后极易解离3. 抗原抗体反应的溶液反应液最适pH为6.5〜8.5,否则不易形成IC,甚至可引起IC解离在一定范围内,离子强度大,IC形成越快;离子的种类也可影响IC的形成一般常使用 磷酸盐缓冲液 作为免疫比浊法的反应液4. 增浊剂某些非离子型亲水剂对促进IC的形成有显著的增强作用,如聚乙二醇(PEG、吐温-20,其作用是消 除蛋白质(抗原或抗体)分子周围的电子云和水化层,促进抗原、抗体分子靠近,结合形成大分子复合物。

      二) 免疫比浊法方法分类1. 透射免疫比浊法 通过检测光被吸收、衍射、反射和折射后 光线减弱的变化,来定量抗原抗体的复合物2. 免疫胶乳比浊法 是以胶乳作为载体 对小分子免疫复合物进行微量测定,进一步提高了免疫浊度测定 的灵敏度3. 散射免疫比浊法通过检测光折射和衍射而形成的 散射光强度来定量抗原抗体的复合物该法根据抗原抗体反应的时间和反应结合的动力学,又可分为终点散射比浊法、固定时间散射比浊法和速率散射比浊法三) 免疫比浊法应用血液、体液中蛋白质的测定如免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、补体C3补体C4血浆蛋白(前白蛋白、a -抗胰蛋白酶、a -酸性糖 蛋白、a 2-巨球蛋白、血浆铜蓝蛋白、结合球蛋白、转铁蛋白)尿微量蛋白系列和半抗原(如激素、毒 物和各种治疗性药物)四) 免疫比浊法优点1. 稳定性好2. 敏感度高(达ng/L )3. 精确度高(CVk 5%4. 简便快速,易于自动化5. 无放射性核素污染,适合于大批量标本的检测第三节凝胶内沉淀试验利用可溶性抗原和相应抗体在凝胶内扩散,形成浓度梯度, 在抗原与抗体浓度比例恰当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环 3. 每次测定时必须用质控血清作质控。

      4. 注意双环现象(出现了两种抗原性相同成分)二、双向扩散试验双向扩散试验是让抗原和抗体在琼脂中各自向对方扩散,在比例恰当之处形成沉淀线,沉淀线的位置、 形状以及对比关系,可对抗原或抗体进行 定性分析双向扩散试验简单易行,用途广泛,但该技术 灵敏度低,出现结果慢,不能精确定量 ,这些弱点在相当程度上限制了它的应用根据试验形式可分为试管法和平板法两种一) 试管法(二) 平板法 是鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一根据沉淀线的有无、形态和位置可作如下分析:1. 抗原或抗体的存在与否以及相对含量的估计(1) 沉淀线如果靠近抗原孔,则表示抗体含量较大;(2) 沉淀线如果靠近抗体孔,则表示抗原含量较大;(3) 不出现沉淀线则表明无对应的抗体(抗原)或者抗原过量 2. 抗原或抗体相对分子量的分析(1) 抗原或抗体在琼脂内自由扩散,其速度受分子量的影响 分子量小者扩散快,反之则较慢2) 由于慢者扩散圈小,局部浓度则较大,形成的 沉淀线弯向分子量大的一方 ;如果两者分子量大致 相等,则形成直线 OAbO +j Ab-O 12*|q3. 抗原性质的分析(1) 两条沉淀线互相吻合相连 ,表明抗体与两个抗原中的相同表位结合而沉淀, 两个抗原相同;(2) 沉淀线呈部分 相切,说明两个抗原之间有 部分相同;(3)两条沉淀线交叉而过,说明两个抗原完全不同。

      制怙O 0何〔AL 1H同泸案全不同⑷o o知亲©as分相伺双简免疫扩敬试验4. 抗体效价的滴定双向扩散试验是抗血清抗体效价滴定的常规方法固定抗原的浓度,稀释抗体;或者抗原和抗体双方 皆作不同的稀释,经过自由扩散,形成沉淀线,以 出现沉淀线最高的抗体稀释度为该抗体的效价 5. 抗原或抗体纯度鉴定用混合抗原或抗体鉴定抗体或抗原,出现 一条沉淀线说明待测抗原或抗体纯,出现多条沉淀线说明不纯双向扩散试验简单易行,用途广泛,但该技术灵敏度低,出现结果慢,不能精确定量,这些弱点在相 当程度上限制了它的应用第四节免疫电泳技术电泳分析与沉淀反应的结合产物一、 优点(一) 加快了沉淀反应的速度;(二) 电场规定了抗原抗体的扩散方向,使其集中,提高了灵敏度;(三) 可将某些蛋白组分根据其带电荷的不同而将其分开,再分别与抗体反应本法既具有抗原抗体反应的高度特异性,又具有电泳技术的高分辨率和快速、微量等特性,因此其应 用范围日益扩大随着实验技术的不断发展,免疫电泳技术逐步发展为对流免疫电泳、火箭免疫电泳、免 疫电泳、免疫固定电泳等多项实验技术,广泛用于科学研究和临床实验诊断分析二、 对流免疫电泳 双向免疫扩散与电泳相结合的定向加速的免疫扩散技术。

      在pH8.6缓冲液中,大多蛋白质带强负电荷,在电场中向正极移动;而 IgG等电点偏高(pH6〜7),在pH8.6时带负电荷较少,且分子量较大,移动速度慢,故向正极移动缓慢甚至不移动在凝胶的 电渗作用下,随水流向负极,电渗引向负极移动的液流速度超过了 IgG向正极的移动速度,因此抗体移向负极,在抗原抗体最适比处形成沉淀线IgG作为蛋白质在电泳中比较特殊, 4个亚型有不同的表现,IgG3和lgG4与一般蛋白质无异,泳向正极,而IgGI和IgG2则因其带电荷少,受电渗的作用力大于电泳,所以被水分子挟裹向负极移动这就形成 了 igG的特殊电泳形式:一部分泳向正极,另一部分泳向负极,在抗体孔两侧都有抗体存在,因此所谓对 流只是部分IgG的电渗作用所致三、火箭免疫电泳单向免疫扩散与电泳相结合的一项 定量检测技术,实质上是 加速的单向扩散试验实验时,将抗体混合于琼脂中,样品孔中的抗原置于负极端,电泳时抗体不移动,抗原向正极泳动,随着抗原量的逐渐减少, 抗原泳动的基底区越来越窄,抗原抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄,形成一个形状如火箭的不溶性 复合物沉淀峰当琼脂中抗体浓度固定时,峰的高度与抗原量呈正相关,因此用已知标准抗原作对照,抗原浓度为横 坐标,峰的高度为纵坐标,绘制标准曲线,待测样品浓度就可根据沉淀峰的高度在标准曲线中计算获得。

      火箭电泳作为抗原定量只能测定 Pg/ml以上的含量,如低于此水平则难以形成可见的沉淀峰加入少量125I标记的标准抗原共同电泳, 则可在含抗体的琼脂中形成不可见的火箭峰, 经洗涤干燥后,用X线胶片显影,可出现放射显影,这就是目前采用的免疫自显影技术,根据自显影火箭峰降低的程度(竞争法)可 计算出抗原的浓度免疫自显影技术可测出 ng/ml的抗原浓度四、免疫电泳区带电泳与免疫双扩散相结合的一种免疫分析技术,为 定性试验先用区带电泳 技术将抗原在凝胶中电泳,分成肉眼不可见的若干区带,电泳停止后,沿电泳方向挖一与之 平行的抗体槽,加入相应抗血清,置室温37C作双向扩散,经18〜24小时后,已分离成区带的各种抗原成分与抗体槽中相应抗体在两者比例 适合处形成弧形沉淀线免疫电泳所需 扩散时间长,沉淀线的数目和分辨率又受许多因素影响 ,且结果较难分析,必须积累经验,才能作出恰当的结论免疫电泳为 定性试验,目前主要应用于 纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异常免疫球蛋白的识别与 鉴定方面,例如多发性骨髓瘤患者血清在免疫电泳后,可观察到异常的 M蛋白沉淀弧五、免疫固定电泳可用于各种蛋白质的鉴定该方法原理是先将待检样品在凝胶板上作 区带电泳,将蛋白质分离成不同区带,然后在 其上覆盖抗血清,当抗血清与某区带中的单克隆免疫球蛋白结合,便形成抗原抗体复合物而 沉淀。

      最后通过漂洗和染色,并与蛋白质参考泳道对照分析,可对各类免疫球蛋白及其轻链进行分型本法可用于迁移率近似的蛋白和 M蛋白的鉴定与分型,免疫球蛋白轻链,尿液中的本-周蛋白检测及K、入分型,脑脊液中寡克隆蛋白的检测及分型,鉴定游离轻链,补体裂解产物等免疫固定电泳最大的优势是分辨率强,敏感度高,操作周期短,仅需数小时,结果易于分析六、交叉免疫电泳将区带电泳和火箭免疫电泳相结合的免疫电泳分析技术是一种有效的抗原蛋白定量技术,可一次同时对多种抗原定量分辨率较高,有利于各种蛋白组分的 比较,对于蛋白质遗传多态性、微小异质性、蛋白质裂解产物和不正常片段等进行定性分析1〜4题共用答案)A. 带现象B. 前带C. 后带D. 等价带E. 拖尾现象1. 沉淀反应中抗原过量的现象称为『正确答案』C『答案解析』沉淀反应中抗原过量的现象称为后带2. 沉淀反应中抗体过量的现象称为『正确答案』B『答案解析』沉淀反应中抗体过量的现象称为前带3. 沉淀反应的反应曲线中,抗原抗体分子比例合适的范围称为『正确答案』D『答案解析』沉淀反应的反应曲线中,抗原抗体分子比例合适的范围称为等价带4. 沉淀反应的反应曲线中,抗原或抗体极度过剩而引起无沉淀物形成的现象称为『正确答案』 A『答案解析』沉淀反应的反应曲线中,抗原或抗体极度过剩而引起无沉淀物形成的现象称为带现象。

      沉淀反应的抗原是A. 颗粒性抗原B. 可溶性抗原C. 半抗原D. 超抗原E. 致敏抗原『正确答案』B『答案解析』沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在特定条件下发生特异性结合时出现的沉淀现象关于免疫浊度法测定错误的是A. 反应液中抗体过量B. 反应液中抗原过量C. 反应液中抗原、抗体比例合适D. 常用聚乙二醇等增浊剂E. 通常用磷酸盐反应液『正确答案』B『答案解析』当抗原过量时,形成。

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