核酸检测篇6-DNase I足迹分析——【国自然标书写作】.pdf

旗开得胜 读万卷书 行万里路 1 编号：2-6 主题：DNase I 足迹试验 概述： DNase I 足迹法于 1978 年引入科研领域，其原理与 DNA 的化学测序法相 似，首先将待测双链 DNA 片段中一条链的一端选择性地进行标记，然后加入 适当浓度的 DNaseI，使在 DNA 链上形成缺口，经过变性后电泳分离，放射自 显影，即形成以相差一个核苷酸为梯度的 DNA 条带但当 DNA 片段与相应的 序列特异性 DNA 结合蛋白结合后，DNA 结合蛋白可保护相应的 DNA 序列不 受 DNase I 的攻击，因此在放射自显影图谱上，DNA 梯度条带在相应的 DNA 结合蛋白的结合区域中断，从而形成一空白区域，恰似蛋白质在 DNA 上留下 的足迹，因而被形象地称作足迹法如果同时进行 DNA 化学测序，即可判断 出结合序列的精确顺序，该技术至今仍然是最常用的方法，但是在实际应用 中，首先应将序列特异蛋白进行一定程度的纯化，如硫酸铵分步沉淀，离子交 换层析，凝胶过滤层析等，否则很难得到满意的结果因此在该足迹法的基础 上又发展了固相 DNaseI 足迹法，它具有如下优点： (1)采用生物素进行末端标 记，避免放射性同位素的掺人，减少危害; (2)省略了有机抽提、沉淀等蛋白纯 化步骤，操作简便，效率高; (3)使用范围广，可适用于未经纯化的核蛋白粗提 物内特异性 DNA 结合蛋白的研究。

DNase I 足迹法常与 EMSA 法结合共同用于体外 DNA-蛋白质相互作用的鉴 定，但二者的侧重点不同. EMSA 主要用于与特异性 DNA 结合的目标蛋白的检 旗开得胜 读万卷书 行万里路 2 测，而 DNase I 足迹法在此基础上进一步证明了 DNA 元件和目标蛋白的特异 结合，并能告知与该蛋白结合的相应 DNA 元件序列 目的： 鉴别 RNA 聚合酶等蛋白质在 DNA 上的结合位点，找到与特异性 DNA 结合的 目标蛋白，而且能告知目标蛋白结合在哪些碱基部位 原理： 将含有特定顺式元件的双链 DNA 片段进行单链单末端标记，与初步纯化的 DNA 结合蛋白在体外行结合作用，然后加入 DNase I 对 DNA-蛋白质复合物 进行随机切割，产生一系列不同长度的 DNA 片段，其相邻片段只相差一个核 苷酸DNA 结合蛋白与其特异序列结合后，由于空间位阻等多种效应， DNase I 不能对其进行切割 步骤： 1. 探针制备及纯化： 构建含启动子片段的质粒，双酶切质粒，同位素标记，回收标记后的启动子片 段 2. DNase足迹分析样品处理： 蛋白质与 DNA 混合，等两者结合后，加入适量的 DNase I，消化 DNA 分子， 控制酶的用量，使之达到每个 DNA 分子只发生一次磷酸二酯键断裂，并列设 置未加蛋白质的对照. 旗开得胜 读万卷书 行万里路 3 3. G+A 化学测序反应和电泳： 从 DNA 上除去蛋白质，将变性的 DNA 加样在测序凝胶中作电泳和放射性自显 影，与对照组相比后解读出足迹部位的核苷酸序列。

流程图： 。