原核基因表达的调控.ppt

单击此处编辑母版标题样式,,,,*,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,单击此处编辑母版标题样式,,,,*,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,第 九 章,,,微生物基因表达调控,概 述,微生物新陈代谢过程中，酶是主要的基因产物；,,微生物在代谢过程中，已经形成了两种主要的代谢调节方式，即酶活性的调节和酶量的调节酶,活性的调节：具体指一定数量的酶通过其分子构象或分子结构的改变来调节其催化反应的速率，主要是生化水平的调节（第五章）酶量的调节包含：,,1,、基因（酶的基因）被转录成多少,mRNA,的,转录水平,的调节2,、,转录后,mRNA,转,译出多少蛋白（酶）的过程基因表达调控,基因表达调控在两个水平上体现：,,(1)　转录水平上的调控(transcriptional regulation);,,(2)　转录后水平上的调控(post-transcriptional regulation);,,,第一节　转录水平的调控,操纵子,：,原核生物细胞中,,,功能相关的基因组成操纵子结构,,,由操纵区与一个或几个结构基因联合起来,,,形成一个结构上、功能上协同作用的整体,,,受统一调节基因和启动区的调控。

调节基因：,可产生阻遏物或激活物蛋白调节操纵区，从而控制结构基因的功能1）非专一性结合蛋白:组蛋白与DNA结合，结果有时影响基因表达2）专一性结合蛋白: 有很多蛋白质可与DNA发生序列特异性相互作用，这些蛋白质分子的氨基酸侧链通过与DNA的碱基磷酸或戊糖分子发生作用；,,结合部位往往在,DNA,大沟中，每条多肽链与一条,DNA,链结合与,DNA,发生特异性相互作用的蛋白质一般是有两条相同的多肽链组成的二聚体一、DNA结合蛋白,,,（1）螺旋－转角－螺旋（helix-turn-helix，HTH）,,HTH的一端是由氨基酸形成的α－螺旋，又称为,识别螺旋,；,“转角”,由3个氨基酸组成；第二个,螺旋,以疏水相互作用稳定第一个螺旋结合蛋白与DNA作用力：氢键、范德华力等非共价作用实例：大肠杆菌的Lac、Trp阻遏蛋白DNA结合蛋白的模体（motif）,,,（2）锌指（zinc finger）多见于真核,,特点: Zn,2+,连结四个氨基酸（2个组氨酸，2个半胱氨酸） 　　　　　 形成α－helix（螺旋）形式的“指”，在大沟中与 DNA相互作用一般多个锌指串联排列， 但不一定每个都接触DNA，其氮端形成反向β折 叠，碳端形成α－helix，与DNA大沟特异性接触。

3）亮氨酸拉扣（leucine zipper）,,多肽链上每隔,7,个氨基酸有一个亮氨酸残基，这些残基形成了一种二聚体化基序亮氨酸拉扣,不与,DNA,相互作用，只是保持另外,2,个,α,螺旋与,DNA,结合，稳定其空间构象三种蛋白的共同特点：以,α,螺旋作为与,DNA,识别（作用）的 　　　　　　　　　　 部位二、操纵子的转录调控,原核生物的基因调控主要发生在转录水平上，根据调控机制的不同可分为,负转录调控,(negative transcription regulation)和,正转录调控,(Positive transcription regulation)负转录调控系统,在负转录调控系统中，调节基因的产物是,阻遏蛋白,(repressor),－－,阻止结构基因转录其作用部位是操纵区它与操纵区结合，转录受阻负控诱导系统－－诱导物不存在时，阻遏蛋白与操纵区相结合，结构基因不转录；诱导物存在时，阻遏蛋白与诱导物相结合，阻遏蛋白与操纵区分离，结构基因转录负控阻遏系统－－当阻遏蛋白与效应物结合时，结构基因不转录正转录调控系统,在正转录调控系统中，调节基因的产物是激活蛋白,(activator),，激活蛋白结合后，,RNA,聚合酶与,DNA,的启动子结合，转录才会进行。

在正控诱导系统中，诱导物的存在使激活蛋白处于活性状态，转录进行在正控阻遏系统中，效应物分子的存在使激活蛋白处于非活性状态，转录不进行操纵子的转录调控实例,㈠、乳糖操纵子-----负控诱导系统;,,㈡、色氨酸操纵子----负控阻遏系统,,,㈠、乳糖操纵子,大肠杆菌能利用乳糖作为碳源，而利用乳糖作为碳源的酶只有当乳糖成为惟一的碳源时才会被合成大肠杆菌乳糖操纵子,(lactose,operon,),包括,3,个结构基因,:Z,、,Y,和,A,这三个结构基因被同一个转录单元,lacZYA,所编码，它有一个启动子,Plac,乳糖操纵子的这三个结构蛋白是作为一个多顺反子的,mRNA,一起表达的lacZYA,转录单元含有一个操纵区,Olac,，,它位于,Plac,启动子,5’,端的,-5,至,+21,之间当阻遏蛋白结合到操纵区时，便成为转录的强抑制物阻遏蛋白被一个独立的调节基因,lac,I,所编码，,lac,I,也是乳糖操纵子的一部分,;,lac,I,位于,Plac,的上游乳糖操纵子的编码产物,lacZ编码,β-半乳糖苷酶，它可以将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖lacY编码半乳糖苷透性酶，它能将乳糖运送透过细菌的细胞壁。

lacA编码硫代半乳糖苷乙酰转移酶阻遏蛋白,操纵序列存在反向重复对称，正好与由四个相同亚基组成的阻遏蛋白的内部对称相匹配当乳糖缺乏时，阻遏蛋白占据了操纵序列的结合位点，,RNA,聚合酶不能与启动子结合乳糖阻抑物阻碍了几乎全部的,lacZYA,的转录而使之保持很低的转录水平乳糖操纵子诱导表达的机理,将乳糖加入细胞中后，细胞本身所含的低量的透性酶使它能吸收乳糖，β-半乳糖苷酶则催化一些乳糖转化为异乳糖异乳糖可以作为诱导物结合到阻遏蛋白上从而引起阻遏蛋白四聚体构象的变化，从而降低其对乳糖操纵序列的亲和力，阻遏蛋白从操纵序列上脱离下来，聚合酶 迅速开始lacZYA基因的转录因此，加入乳糖或合成诱导物如异丙基,-β-D-,硫代半乳糖苷,(IPTG),能非常迅速地刺激乳糖操纵子结构基因的转录调节基因,操纵区,乳糖结构基因,P,LacZ,LacY,LacA,mRNA,阻遏蛋白（有活性）,基 因 关 闭,启动子,O,R,P,LacZ,LacY,LacA,调节基因,操纵基因,乳糖结构基因,启动子,O,R,阻遏蛋白（无活性）,基 因 表达,mRNA,A、乳糖操纵子的结构,B、乳糖酶的诱导,异乳糖,阻遏蛋白（有活性）,乳糖操纵子的负调控,mRNAZ,mRNAY,mRNAA,,,cAMP,即环式,AMP,，,其在生物表达调控过程中起着重要作用。

葡萄糖的降解代谢会抑制一些操纵子的转录cAMP,在细胞中的增加对这些操纵子的转录是有利的葡萄糖降解物能抑制细胞内,cAMP,产生这是因为,ATP,是,cAMP,的直接代谢前体，担任这种转化的酶是腺苷酸环化酶,(,adenylcyclase,),，,此酶受葡萄糖代谢降解物的直接抑制,,,从而造成,cAMP,不能产生分解代谢物阻遏调控（葡萄糖效应）,,,分解代谢激活蛋白,(CAP),是以以二聚体形式存在的葡萄糖存在时会降低细胞内,cAMP,的水平，,CRP,自身不能独立与,DNA,结合；,,当葡萄糖缺乏时，大肠杆菌细胞内,cAMP,水平上升，,CRP,结合到,cAMP,上CRP-,cAMP,复合物可结合到紧邻,RNA,聚合酶结合位点上游的乳糖操纵子的启动子,Plac,上游能使,DNA,双螺旋发生弯曲，有利于形成稳定的开放型启动子,-RNA,聚合酶结构，使转录效率提高,50,倍分解代谢激活蛋白,,,R,LacZ,LacY,LacA,mRNA,基 因 表达,CAP基因,结构基因,T,CAP,O,CAP结合部位,RNA聚合酶,T,cAMP,-,CAP,P,葡萄糖,分解代谢产物,腺苷酸环化酶,磷酸二酯酶,ATP,cAMP,5'-AMP,抑制,激活,葡萄糖降解物与cAMP的关系,cAMP,CAP：降解物基因活化蛋白（catabolic gene activation protein）,降低,cAMP,浓度,使,CAP,呈失活状态,mRNAZ,mRNAY,mRNAA,,,lac 操纵子小结,通常情况（葡萄糖供应正常）阻遏蛋白与操纵序列结合，基因不转录。

细胞外的乳糖通过透性酶吸收到细胞内；细胞内的,β-,半乳糖苷酶将乳糖转变为异乳糖异乳糖结合到阻遏蛋白上使之从操纵序列上脱离，聚合酶迅速开始,lacZYA,基因的转录这就是负控诱导此外，体系还存在分解代谢物阻遏调控：细菌生长系统中若缺少葡萄糖，使,cAMP,含量增加，才有足够量的,cAMP,与分解物结合蛋白（,CRP,）结合形成,CRP-,cAMP,复合物结合于,Plac,上游使,DNA,双螺旋发生构象变化，转录才可以有效地进行㈡、色氨酸操纵子,色氨酸操纵子包括色氨酸合成途经中相关的,5,个结构基因，编码一个转录单元，即从色氨酸启动子,Ptrp,、操纵基因位点,Otrp,和向下游转录出,7kb,的转录物色氨酸阻抑物,色氨酸操纵子中产生阻遏蛋白的基因是,trpR,，阻遏蛋白是含有两个亚基的二聚体,,,,可与色氨酸操纵子的操纵区特异性相互作用操纵区的部分对称序列与色氨酸启动子在,-21,和,+3,碱基之间重叠中心结合区是,18,个碱基的回文结构只有当色氨酸结合到阻遏蛋白上时，阻遏蛋白才处于正确的构象，与色氨酸操纵区相互作用 ，将转录的起始减少了大约,70,倍当合成产物积累时，阻遏蛋白被,,合成产物激活而与操纵基因结合,辅阻遏物（合成产物）,阻遏蛋白,当合成产物减少时，合成产物,,脱离阻遏蛋白而使阻遏蛋白失,,活。

转录酶使结构基因转录，,,蛋白质酶合成使合成代谢开始,色氨酸操纵子：,,色氨酸积累时色氨酸合成减弱,,色氨酸缺乏时色氨酸合成加强,,色氨酸＝合成产物＝辅阻遏物,,,弱化子,如果在操纵基因和,trpE,基因编码序列之间的一段序列缺失，会导致基本转录水平和活化,(,解阻抑,)--,转录水平的上升该段序列称为,弱化子,，它位于,trpE,起始密码子前面,162bp,的转录前导序列的,123,～,150,位弱化子是一个不依赖,ρ,因子的终止子区域，在一小段富含,GC,的回文结构之后是,8,个连续的,U,残基如果这段序列能在,RNA,转录物中形成发夹结构，就可以作为一个高效的转录终止子，因而只有,140bp,的转录物被合成前导RNA结构,色氨酸操纵子,RNA,的前导序列含有,4,个序列互补区，能形成不同的碱基配对的,RNA,结构它们被称为序列,1,、,2,、,3,和,4,弱化子发夹结构是序列,3,和,4,配对的产物,(3:4,结构,),序列,1,和,2,也是互补的，能形成另一个发夹结构,1:2,然而序列,2,还和序列,3,互补如果序列,2,和,3,形成,2:3,发夹结构,，,3:4,弱化子发夹结构就不能形成，转录就不会终止。

在正常情况下，,1:2,和,3:4,发夹结构的形成在能量上是有利的弱化作用,大肠杆菌中，翻译在,mRNA,边转录时边进行色氨酸前导肽编码序列的,3‘,端与互补序列,1,重叠，两个色氨酸密码子都在序列,1,内，终止密码子在序列,1,和,2,之间由于色氨酸,(,色氨酸操纵子的最终产物,),是翻译过程中所必需的，因此细胞对它的含量很敏感，它决定了在,mRNA,中终止子,(3:4),发夹结构是否形成在色氨酸操纵子转录进行的过程中，,RNA,聚合酶在序列,2,的末端停滞直到核糖体开始翻译前导肽（即当前导肽开始翻译时，,RNA,聚合酶才又继续沿,DNA,模板链前进合成,RNA,）在,色氨酸含量很高,的情况下，核糖体迅速在两个色氨酸密码子处插入色氨酸，这样翻译可直达前肽导末端核糖体封闭了序列,2,，当,RNA,聚合酶把,3,区和,4,区转录出来时，,3:4,发夹得以形成，当,RNA,聚合酶到达终止序列时，由于,3:4,发夹使转录可能被终止这一过程被称为,弱化作用图,9,－,20,弱化作用模型,,,如果色氨酸缺乏时,，翻译过程中将缺少其氨酰－tRNA，核糖体将在两个色氨酸密码子上滞留，封闭了序列1这使得序列2能自由地与序列3形成发夹结构（即抗终止子）。

终止子 (3:4)发夹结构不能形成，转录继续到trpE及其下游因此终产物色氨酸含量的高低决定了转录是提早终止 (弱化)，还是继续转录完整个操纵子弱化的重要性,依靠弱化作用，色氨酸的存在就使色氨酸操纵子的转录被抑制了,10,倍与色氨酸阻抑物的作用,(70,倍,),合在一起，这就意味着色氨酸水平对色氨酸操纵子的表达施加了,700,倍的调节效果在六种与氨基酸的生物合成相关的操纵子中有弱化作用例如,his,操纵子含有编码一个有连续,7,个组氨酸密码子的多肽的前导序列三 细菌应急反应,当细菌发现它们自己生长在饥饿的条件下，缺乏维持蛋白质合成的氨基酸时，它们将大部分活性区域都关闭掉此就称为严紧反应,(,strigent,response),，这是它们抵御不良条件，保存自己的一种机制严紧反应导致两种特殊核苷酸积聚：,(1)ppGpp—,四磷酸鸟苷（在,G,的,5',和,3',位点各附着两个磷酸）,;(2),pppGpp,—,五磷酸鸟苷（鸟苷,5',一三磷酸,-3',二磷酸）人们最初发现细菌在氨基酸饥饿时，出现两种特殊的核苷酸，其电泳的迁移率和一般的核酸不同，感到很奇怪，就称之为“魔斑,Ⅰ”,和“魔斑,Ⅱ”,，后来发现魔斑,Ⅰ,便是,ppGpp,，魔斑,Ⅱ,是,pppGpp,。

ppGpp,有什么作用呢？它是一系列反应的效应物，包括抑制转录1,）,rRNA,操纵子的启动子其转录起始被严紧反应特异抑制了严紧调节的启动子发生突变能消除严紧控制，表明此效应需要和特异启动子顺序相互作用；,,（,2,）很多或大部分模板的转录延伸阶段被,ppGpp,缩短了，此是,RNA,聚合酶停顿的增加而引起的此效应反应了在细胞内加入,ppGpp,时转录效率普遍下降四、通过σ因子更换的调控,枯草芽孢杆菌芽孢形成过程中，通过有序,σ,因子,替换，使芽孢形成的基因有序表达热激应答反应：存在每一种生物中HSP70,热激蛋白感受温度变化后，调节热激应答系统的调节蛋白基因,rPOH,表达，产物是,σ32,，其参与构成的,RNA,聚合酶识别热激应答基因的启动子五、信号传导和二组分调节系统,前面讨论的是小分子效应物与调节蛋白作用，而有时外部信号不直接传给调节蛋白通过传感器检测信号，然后以变化形式传到调节部位，此为信号传导最简单是,二组分系统,由：,CM,传感蛋白或传感激酶 （细胞质膜上）,,CP,的应答调节蛋白 （细胞质）,,,,图,9,－,26,缺氧激活,ArcB,蛋白，磷酸化为,ArcA,，作为阻遏蛋白,,作用,THT,模式蛋白，作用,DNA,分子，对操纵子调节,,,二组分系统在许多细菌调节大量基因，如：大肠杆菌氮吸收；根瘤菌氮固定；芽孢菌芽孢形成。

趋化性（,chemotaxis,）：,也是二组分调控系统调控其,机理：,接受甲基趋化性蛋白（,MCPs,）是受体蛋白，传感激酶是,CheA,六 λ溶原与裂解途径的转录调控,图,9,－,29,λ基因组,A,～,Z,头部基因,,N,：早期调节因子,,C,Ⅲ:CⅡ稳定因子,,CⅠ：阻遏蛋白,,,,主要是,Cro,和,C,Ⅰ两种调节蛋白Cro,蛋白对,cro,和,c,Ⅰ,基因负控制,,C,Ⅰ,蛋白对,cro,转录负控制，对自身既有正控制又有负控制溶原途径：只有,c,Ⅰ,基因表达，,C,Ⅰ,蛋白先与O,R,O,L,结合，阻止P,L,P,R,启动占据O,R,，抑制cro,不利裂解,图,9-30,控制区,,,,当溶原菌受,uv,或其他因素诱导，,RecA,蛋白激活,,切,C,Ⅰ,蛋白，从DNA脱落，使RNA聚合酶与,cro,,结合表达，头尾基因表达，进入裂解途径第二节 转录后调控,基因表达的转录调控是生物最经济的调控方式,――,用不着某种蛋白质，其,mRNA,由于用不着就不必转录转录生成,mRNA,以后，再在翻译或翻译后水平进行,",微调,",，是对转录调控的补充，它使基因表达的调控更加适应生物本身的需求和外界条件的变化。

1 翻译起始的调控,遗传信息翻译成多肽链起始于而,mRNA,上的核糖体结合位点,(RBS),所谓,RBS,，是指起始密码子,AUG,上游的一段非翻译区在,RBS,中有,SD(Shine-Dalg-arno,),序列，长度一般为,5,个核苷酸，富含,G,、,A,，该序列与核糖体,16SrRNA,的,3‘,端互补配对，促使核糖体结合到,mRNA,上，有利于翻译的起始RBS,的结合强度取决于,SD,序列的结构及其与起始密码,AUG,之间的距离SD,与,AUG,之间相距一般以,4-10,个核苷酸为佳，,9,个核苷酸最佳mRNA,的二级结构是翻译起始调控的重要因素mRNA 5’,端合适的空间结构有利于核糖体的,30 S,亚基与之相结合SD,序列的微小变化，往往会导致表达效率上百倍甚至上千倍的差异，这是由于核苷酸的变化改变了形成,mRNA 5’,端二级结构的自由能，影响了核糖体,30 S,亚基与,mRNA,的结合，从而造成了蛋白质合成效率上的差异mRNA的稳定性,mRNA,的稳定性也是影响翻译效率的一个很重要的因素，基因的表达量与,mRNA,的半衰期成正比例关系同一种微生物细胞中不同蛋白质的,mRNA,的稳定性相差很大，例如大肠杆菌的,mRNA,功能性半衰期的差异可在,40,秒至,20,分钟之间，对不同基因的表达量起调控作用。

3 稀有密码子对翻译的影响,在不同种类的生物中，各种,tRNA,的含量是有很大区别的，特别是原核生物尤为显著由于不同,tRNA,含量上的差异很大，产生了对密码子的偏爱性，对应的,tRNA,丰富或稀少的密码子，分别称为偏爱密码子,(biased,codons,),或稀有密码子,(rare,codons,),含稀有密码子多的基因必然表达效率低微生物利用稀有密码子进行转录后调控主要反映在对同一操纵子中不同基因表达量的控制4 重叠基因对翻译的影响,trp操纵子由5个基因(trpE、D、C、B、A)组成，在正常情况下，操纵子中5个基因产物是等量的，但trpE突变后，其邻近的trpD产量比下游的trpBA产量要低得多研究trpE和trpD以及trpB和trpA两对基因中核苷酸序列与翻译偶联的关系，发现trpE基因的终止密码子和trpD基因的起始密码子共用一个核苷酸trpE --苏氨酸--苯丙氨酸--终止,,ACU----UUC----UGA----UGG -- CU,,AUG----GCU,,甲硫氨酸--丙氨酸---trpD,,,由于trpE的终止密码子与trpD的起始密码重叠，trpE翻译终止时核糖体立即处在起始环境中，这种重叠的密码保证了同一核糖体对两个连续基因进行翻译的机制。

偶联翻译是保证两个基因产物在数量上相等的重要手段5. 反义RNA调控,八十年代以来，关于RNA在细胞内的生物学功能研究取得了重要进展，除了证明RNA具有催化功能(即Ribozyme)之外，还表明RNA具有调节基因表达的功能这种调节RNA被称为反义RNA( antisense RNA)，它具有能与另一“靶”RNA互补结合的碱基序列反义RNA能专一性地结合到mRNA并阻止其活性的事实具有很大的潜在实用性反义RNA已经成为一种研究工具如果有人需要研究某一特定基因的作用能与这个基因的mRNA相结合的反义RNA可以被构建出来并导入到细胞中，它可阻止基因表达6. 翻译的阻遏调控,转录水平的调控一般都是蛋白质或某些小分子物质对基因转录的阻遏或激活，而在翻译水平上也发现了类似的蛋白质阻遏作用7. ppGpp对核糖体蛋白质合成的影响,即在氨基酸短缺的情况下，首先被停止合成的是,rRNA,而核糖体是由,rRNA,和核糖体蛋白质构成，是翻译遗传密码的唯一场所，,rRNA,的量骤然下降，核糖体蛋白质失去了结合的对象而成为多余的了由于某些核糖体蛋白,mRNA,的部分二级结构和,rRNA,的部分二级结构相似，当,rRNA,短缺时，多余的核糖体蛋白质与本身的,mRNA,结合，从而阻断本身的翻译，同时也阻断同一多顺反子的,mRNA,下游其他核糖体蛋白质编码区的翻译，使核糖体蛋白质的合成和,rRNA,的合成几乎同时停止。

rRNA,的合成是转录水平的调控，而核糖体蛋白质的合成则是翻译水平的调控8. 细菌蛋白质的分泌调控,能分泌到胞外的蛋白质统称为分泌蛋白由于发现这些分泌蛋白质,N,末端都含有一段由,15,～,30,个疏水氨基酸残基组成的信号肽,(signal peptide),，所以近年来，人们提出了一种信号肽假说来解释这些分泌蛋白质的分泌原核细胞信号序列的发现要比真核细胞的晚得多小 结,微生物基因表达的调控主要在转录水平上，这是最经济的调控方式；但也有转录后的微调；,,操纵子转录调控是微生物的主要调控机制，分负转录调控和正转录调控，分别涉及到阻遏蛋白或激活蛋白与,DNA,分子的相互作用；,,转录后调控主要包括,①,翻译起始的调控；,②,mRNA,的稳定性；,③,稀有密码子和重叠基因；,④,反义,RNA,；,⑤,翻译的阻遏；,⑥,ppGpp,对核糖体蛋白质合成的影响；,⑦,细菌蛋白质的分泌调控思考题,1.以乳糖操纵子为例说明酶诱导合成的调控过程?,,2.以色氨酸操纵子为例简述原核细胞基因表达调控原理图,9,－,32,信号肽,信号肽,N,有,15,～,30aa,疏水性信号肽图,9,－,4 DNA,与蛋白相互识别和结合,,,,,,,图,9,－,8,蛋白,HTH,模式,,,,,,,图,9,－,7,锌指结构蛋白,,,,,,,图,9,－,9,亮氨酸拉链,,,无乳糖时,有乳糖时,,,,,,,图,9,－,11,乳糖,,操纵子结构,,基因依次表达,,,图,9,－,17,色氨酸操纵子,,上面是低,Trp,，下面是高,Trp,时,,,。