第二十章 毛细管电泳法(第七版).ppt

仪器分析仪器分析第二十章 毛细管电泳法第一节 概述电电泳（Electrophoresis)是指溶液中带电 粒子在电场 的作用下向与 自身带相反电荷的电极移动的现象将电泳发展成为分离技术 应归 功于Tiselius的工作他于1937年建立“移界电泳（moving boundary electrophoresis)”，成功地将人血清中的蛋白质分为白蛋 白、α、β、和γ球蛋白，这项 工作成为蛋白质化学发展的基础， 因此Tiselius本人荣获1948年诺贝 尔化学奖仪器分析仪器分析第二十章 毛细管电泳法高效毛细管电泳 经典电泳法散热差，分离电压受到限制1981年，Jorgenson和Lukacs发发表了在毛细细管电电泳发发展史上具有划时时代意义义的工作，他们们采用75μm内径的石英毛细细管做为为分离室，紫外柱上检测检测 的方法，在30kv的分离电压电压 下分离丹酰酰化氨基酸，柱效达到40万个理论论塔板他们们的工作为为毛细细管电电泳的发发展奠定了基础础James W. JorgensonNorth Illinois University化学系教授仪器分析仪器分析第二十章 毛细管电泳法仪器分析仪器分析第二十章 毛细管电泳法第二节 基本理论一. 电渗u电渗（electroosmosis)是毛细管电泳分离理论中最基本的概念之一。

电渗是指在电场作用下，毛细管中或固相多孔物质内，液体沿固体表面移动的现象电渗与固液两相界面的双电层有着密切关系电电渗速度uos以下式表示： 仪器分析仪器分析第二十章 毛细管电泳法u石英毛细管壁上的硅羟基在水溶液中发生电离，所产生的SiO-负离子使毛细管壁带负电荷溶液中的抗衡离子靠静电吸附和分子扩散在固液界面上形成双电层（electric double layer)，双电层包括紧密层和扩散层仪器分析仪器分析第二十章 毛细管电泳法HPLC由于压差产生抛物线型的流体流速轮廓电渗流的流速轮廓是一个平面，在毛细管中如同瓶塞一样流动，不存在径向的流速梯度这是毛细管电泳分离柱效高于HPLC的原因之一u在电场作用下，固液两相间的相对运动发生在紧密层与扩散层之间的 滑动面上 由于离子的溶剂化作用，当形成扩散层的离子在电场中移动时，携带 着液体一同移动，因此产生电渗流（electroosmotic flow,EOF）仪器分析仪器分析第二十章 毛细管电泳法缓冲液pH对电渗流的影响随着pH的增大，石英管壁表面的硅羟基解离度增加，界面有效电荷密度增大， EOF随之增大阳离子型的表面活性剂剂使电电渗流 发发生反转转a.无表面活性剂剂存在；b．阳离子表 面活性剂剂在毛细细管壁表面的吸附 ，抵消了原来的负电负电 荷，使电电渗 迁移率0；c.继续继续 增大阳离子表面 活性剂剂的浓浓度，阳离子表面活性 剂剂分子通过过非极性链链疏水相互作 用，在毛细细管柱表面形成双分子 层层，使电电渗流反转转.u在缓缓冲液中加入有机添加剂剂，如甲醇、异丙醇等，或水溶性高分子物质质，对对EOF也有较显较显 著的抑制作用。

仪器分析仪器分析第二十章 毛细管电泳法u电泳（electrophoresis）是指溶液中带电粒子（离子）在电场 中定向移动的现象u电泳迁移速度 uep 为：式中 －电泳迁移率（电泳淌度） （electrophoresis mobility)（m2/V.s）V－毛细管柱两端施加的电压, L－毛细管柱长二 . 电电泳△在空心毛细细管中一个粒子的淌度可近似表示为为： 仪器分析仪器分析第二十章 毛细管电泳法三、表观淌度表观淌度表观迁移速度正离子μeff+μosueff+ uos中性分子μosuos负离子μeff-μosueff - uos由于电电渗流速度大大高于电电泳速度，所以，不管正离子、负负离子还还 是中性分子，均随电电渗流移动动仪器分析仪器分析第二十章 毛细管电泳法u物质在毛细管中的保留时间为：Ld为毛细管柱进样端至检测窗口的距离（有效长度）四、分离效率和谱带谱带 展宽宽（一）理论论板数和板高仪器分析仪器分析第二十章 毛细管电泳法毛细细管电电泳分离柱效方程u从分离柱效方程可知：（1）分离电压电压 V↑, n↑（2）V一定时时，Ld/L ↑, n↑（3）扩扩散系数D↓, n↑；大分子的D小，故CE对对大分子分离柱效高。

仪器分析仪器分析第二十章 毛细管电泳法（二）引起区带展宽的因素1.分子扩散2.焦耳热电流通过毛细管中的电解质溶液时会产生焦耳热，使毛细管内及周围温度分布由于毛细管柱中沿径向存在一个抛物线型的温度梯度，由此引起介质的粘度在径向上的梯度分布，进而引起径向上的电泳速度梯度仪器分析仪器分析第二十章 毛细管电泳法3.吸附产生原因： （1）阳离子溶质和带负电的管壁的离子相互作用（2）疏水作用对于生物大分子，如碱性蛋白和多肽等，吸附严重时可能导致测不到信号因此，生物大分子分析时常需用涂层处理的毛细管柱 4.进样 （过载）5.电泳样品区带与周围电解质溶液间的电导率差，从而导致峰形展宽仪器分析仪器分析第二十章 毛细管电泳法u分离度是指将淌度相近的组分分离的能力 分离度也可表示为为柱效的函数： 讨论讨论 ：分离度是下列因素的函数：①外加电压电压 V；②有效柱长长与总长总长 度之比（Ld/L）；③电电泳有效淌度差；④电电渗淌度 五、分离度仪器分析仪器分析第二十章 毛细管电泳法第三节 毛细管电泳的主要分离模式 u毛细管区带电泳（capillary zone electrophoresis，CZE）u胶束电动色谱（micellar electrokinetic chromatography, MEKC)u毛细管凝胶电泳（capillary gel electrophoresis, CGE)u毛细管等速电泳（capillary isotachophoresis, CITP)u 毛细管等电聚焦（capillary isoelectric focus, CIF)u毛细管电色谱（capillary electrochromatography, CEC)仪器分析仪器分析第二十章 毛细管电泳法一、毛细管区带电泳（CZE）毛细管电泳最基本的分离模式。

背景电解质是缓冲液，分离是基于样品中 各个组分间质荷比的差异有时需在缓冲液中加入一定的添加剂，用以提 高分离选择性，改变电渗流的大小、方向或抑制毛细管壁的吸附等在CZE中，影响分离的操作条件为：√ 分离电压√背景电解质种类、浓度和pH√添加剂种类和浓度 仪器分析仪器分析第二十章 毛细管电泳法u分离效率与电压间存在极大值极大电压通常也是最佳工作 电压u在实际分离中，如果所用的毛细管很细或缓冲液的电导很低 ，极大电压可能会超出仪器范围，此时没有最佳电压，可选 择仪器允许的最大输出电压u当毛细管较粗或缓冲液电导较高时，极大电压可能很小，若 此时分离度很高，也可选择大于极大值的电压进行分离1. 分离电压电压仪器分析仪器分析第二十章 毛细管电泳法u毛细管的温度不仅影响分离的重视性，而且影响分离效率 温度选择应考虑热效应、分析重现性、分离效率和分离 介质对温度的限制等因素u温度的确定也应通过实验，多数情况下，在20～30℃之间 进行电泳，能获得良好的分离效果可根据初步分离结果 调整温度u不少糖类样品需要高于室温的分离环境，一些样品如蛋白 等则可能需要低于室温的分离条件2.分离温度仪器分析仪器分析第二十章 毛细管电泳法对背景电解质的要求：①在所选择的pH范围内有足够大的缓冲容量。

②在检测波长处的吸收低③自身的淌度低，即分子大而荷电小，以减少电流的产生④应使被测组分带合适的电荷量，以实现有效进样和有合适的电泳 淌度⑤尽可能采用酸性缓冲溶液，在低pH下，吸附和电渗流值都很小⑥与毛细管种类匹配，涂层毛细管只能在一定pH范围内使用 3. 背景电电解质质仪器分析仪器分析第二十章 毛细管电泳法在CZE中，常用于毛细管电泳的缓冲溶液有硼砂、磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐和醋酸盐等缓冲体系的pH值要求与样品的性质有关，通常酸性组分的分离选择在碱性条件下进行，而碱性组分则选择酸性介质分离，蛋白质、多肽、氨基酸等两性物质，可选酸性(pH2)也可选碱性(pH>9)分离介质糖类样品通常在pH9~11之间能获得最佳分离，羧酸或其它样品多在pH5~9之间选择分离条件仪器分析仪器分析第二十章 毛细管电泳法upH的选择也和毛细管种类有关，很多涂层毛细管只能在一定pH范围内使用，如聚丙烯酰胺涂层毛细管，只能在pH4~9范围内使用，否则涂层易水解失效u在相同的pH下，不同缓冲体系的分离效果可能相差很大，一般来说，能与样品发生相互作用的试剂可能是最好的 如分离糖类和DNA等分子时优先使用硼酸盐缓冲体系，因为硼酸根能与糖羟基形成配位键，从而增加糖的负电荷和分离度。

硼酸盐缓冲体系也适用于其它含邻羟基或多羟基的化合物分离仪器分析仪器分析第二十章 毛细管电泳法为了选择合适的pH值，需要pH调节剂调整介质的酸碱性 由于多数缓冲试剂属酸性物质，如磷酸，所以pH调节剂主要是碱 类，常用的pH调节剂有NaOH、KOH、Tris等有时也可考虑用胺或醇胺等有机碱，如乙醇胺、乙二胺如果缓冲试剂为碱类， 则可用酸作为调节剂，尽量使用弱酸，如 H3PO4缓冲剂及调节剂的浓度对改善分离、抑制吸附、控制焦耳热 等均有影响，一般缓冲试剂的浓度控制在10～200mmol/L，有时 为了抑制蛋白质等的吸附作用，可用高达500mmol/L的浓度（此时应减少分离电压）电导率高的缓冲试剂如磷酸盐和硼酸盐等 ，一般控制在20mmol/L，电导小的缓冲试剂如硼酸其浓度可在 100mmol/L以上仪器分析仪器分析第二十章 毛细管电泳法如果缓冲体系经各种参数优化后仍无法给出良好的分离结果，可以加入添加剂以改善分离添加剂种类较多：1.无机电解质（NaCl、KCl）2.有机溶剂（如甲醇、乙腈）3.非电解质高分子（纤维素、多糖、聚乙烯醇、Triton X-100)4. 功能性添加剂（手性冠醚、环糊精等）仪器分析仪器分析第二十章 毛细管电泳法二、胶束电动色谱（MEKC）在缓冲溶液中加入离子型表面活性剂（如SDS），当表面活性剂浓度超过 其临界胶束浓度时，则形成亲水胶束，胶束具有疏水内核, 外层带负电荷。

溶质分子则在极性缓冲液与胶束中心的非极性相（假固定相）之间有一定的 分配中性分子因其本身疏水性不同，在两相中分配存在差异在电渗流作 用下，胶束携带溶质一起前行，疏水性强的溶质和胶束结合得较牢，流出慢 不同分子在两相中的分配差异是MECC分离的基础仪器分析仪器分析第二十章 毛细管电泳法u常用的阴离子表面活性剂有十二烷基硫酸钠（SDS） 、N-月桂酰-N-甲基牛磺酸钠（LMT）、牛磺脱氧胆 酸钠（STDC）等u阳离子表面活性剂最常用的是季铵盐，如十二烷基三 甲基溴化铵（DTAB）、十六烷基三甲基溴化铵（ CTAB）等u非离子型表面活性剂有3-[3-(氯化酰胺基丙基)二甲基 胺基]-1-丙基磺酸酯（CHAPS）等u另外，还有手性表面活性剂，如胆酸、毛地黄皂苷、 十二烷基-N-L-缬氨酸钠等 仪器分析仪器分析第二十章 毛细管电泳法表面活性剂选择时应考虑以下因素：u（1）经济易得u（2）水溶性好u（3）紫外吸收背景越低越好u（4）不与样品发生破坏性作用u（5）所形成的胶束足够稳定仪器分析仪器分析第二十章 毛细管电泳法u碳链较短的阴离子表面活性剂为优先选择对象SDS易得、紫外吸收低，最为常用。

如经浓度、缓冲溶液及pH优化，分离仍不佳，再换具有不同碳链长度或结构的其它阴离子表面活性剂若结果仍不好，应考虑使用阳离子或中性、两性表面活性剂，如CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）、Triton X-100等u应注意：阳离子表面活性剂可能会改变电渗流方向u胶束修。