局部Ang Ⅱ水平与ERK的活化在人门静脉高压症脾静脉血管病变中的作用.doc

1局部 Ang Ⅱ水平与 ERK 的活化在人门静脉高压症脾静脉血管病变中的作用作者：李灵， 池闽辉， 曾金华， 许昌声， 刘景丰【摘要 】 目的 探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)水平与细胞外信号调节激酶(ERK)活化在人门静脉高压症(PHT)脾静脉血管病变中的作用及可能机制 方法 选取乙型肝炎感染后肝硬化 PHT 患者 26 例为PHT 组; 选取因外伤性脾破裂行脾切除术患者 10 例为对照组放射免疫分析法(RIA)检测脾静脉中 AngⅡ水平;免疫组织化学法和蛋白免疫印迹法检测脾静脉中 ERK 的表达 结果 PHT 组脾静脉组织AngⅡ水平(248.91±48.31) ng/L，显著高于对照组(143.35±36.45) ng/L(P<0.01)蛋白免疫印迹 /免疫组织化学染色均显示 PHT 组脾静脉 ERK 表达较对照组明显增加 结论 PHT 时脾静脉组织AngⅡ水平升高，ERK 表达增加局部 AngⅡ升高及 ERK 信号传导通路的激活可能与门静脉高压症的形成和维持有关 【关键词】 高血压，门静脉; 脾静脉; 血管紧张素Ⅱ; 钙- 钙调素依赖性蛋白激酶近年研究发现门静脉高压症(portal hypertension，PHT)患者脾静脉局部血管紧张素原 mRNA 水平升高[1]，提示局部肾素-血管紧2张素系统(renin-angiotensin system， RAS)激活可能在门静脉高压血管病变中起重要作用，但其机制仍不清楚。

笔者通过检测脾静脉组织局部血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)水平、脾静脉组织中细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)蛋白表达，探讨 AngⅡ及 ERK 信号传导通路在门静脉高压症发生机制中的作用1 对象与方法1.1 对象 PHT 组脾静脉 26 例取自因乙型肝炎感染后肝硬化PHT 脾功能亢进行脾切除+ 选择性贲门周围血管离断术患者，男性l6 例，女性 10 例，年龄(45.1±10.2)岁(30~65 岁)，肝功能均为Child B 级全组均无高血压病及糖尿病病史对照组 10 例脾静脉取自因外伤性脾破裂而行脾切除的患者，年龄(44.3±9.8)岁(29~63岁)，均无肝炎、高血压病及糖尿病病史每例脾脏切除后立即于脾门部无菌操作切取脾静脉，所取脾静脉分为 2 部分，一部分福尔马林固定，石蜡包埋，切片，行免疫组织化学检测;另一部分立即置于液氮中保存，行蛋白免疫印迹1.2 方法1.2.1 放射免疫分析法 (radioimmunoassay，RIA) 检测脾静3脉组织中 AngⅡ的含量 取 150 mg 血管组织放入匀浆管中，加入预冷的 0.9%氯化钠溶液中(1 mL/100 mg)，冰浴匀浆，再将该匀浆液置于预冷的含 EDTA 二钠 3.0 mmol/L、8-羟基喹啉 3.4 mmol/L和二巯基丙醇 3.2 mmol/L 的试管中，煮沸 10 min，4 ℃ 3 000 r/min 离心 10 min，取上清液，测定采用 125I-AngⅡ 标记的放射免疫分析，以 SN-628B-3 型放射免疫 γ-计数器记录结果。

1.2.2 免疫组织化学法检测脾静脉组织中 ERK 的表达 切片脱蜡至水，加 3% H2O2 5 min，PBS 冲洗 5 min，重复 3 次，加非特异性血清，室温 30 min，弃上清加入 1∶500 ERK 抗体(Santa Cruz Biotechnology Inc)，37 ℃孵育 1.5 h，PBS 冲洗 5 min，重复 3 次，加酶标二抗(即用型，北京中杉)，室温 30 min，PBS 冲洗5 min，重复 3 次，DAB 显色，苏木素复染计算机图像分析系统分析，光密度值表示 ERK 表达水平1.2.3 蛋白免疫印迹法检测 ERK 的表达 采用细胞裂解液进行脾静脉组织总蛋白提取及制备蛋白样品经电泳，转膜，3%脱脂奶封闭 30 min，加一抗(1∶500)4 ℃孵育过夜，TBS 漂洗 5 min，重复 3 次，加二抗(1∶2 000)37 ℃孵育 1 h，TBS 漂洗 5 min，重复3 次，加鲁米诺，胶片上显影，显影信号的强弱用光密度分析，目标蛋白与 β-actin(OD)比值表示蛋白表达相对量41.3 统计学处理 数据以 x±s 表示，应用 SPSS 13.0 统计软件处理，两组之间均数比较用 t 检验，P<0.05 为差别有统计学意义。

2 结 果2.1 PHT 组与对照组脾静脉组织 AngⅡ水平比较 PHT 组AngⅡ为(248.91±48.31)ng·L-1，显著高于对照组(143.35±36.45) ng·L-1(P<0.01)2.2 PHT 组与对照组脾静脉组织 ERK 表达比较 免疫组织化学检测脾静脉组织中 ERK 表达显示，PHT 组表达阳性细胞大部分位于增厚的中膜和内膜，阳性部位定位于细胞核及细胞质，免疫组织化学计算机图像分析光密度值明显高于对照组(图 1~2);Western-blot 检测脾静脉组织中 ERK 表达显示，PHT 组明显高于对照组(P<0.01，图 3)ERK: 细胞外信号调节激酶;PHT：门静脉高压症. A：PHT 组，大量胞核和胞质中可见棕黄色颗粒;B：对照组，胞质及胞胲中可见少许棕黄色颗粒.3 讨 论5PHT 患者除了血流动力学的紊乱外，门静脉系统还存在血管病变这种病变既是 PHT 的结果，又是门静脉高动力循环维持和加重、促进 PHT 形成和发展的原因门静脉系统的内脏血管病变包括血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)的表型转化以及内脏静脉的血管重构。

中膜平滑肌增殖、肥大和迁移是 PHT 内脏静脉病变的基础[2-3]研究证明 AngⅡ是一种强烈的促有丝分裂剂，局部旁分泌和自分泌的 Ang Ⅱ有明显的促细胞增殖、 ERK: 细胞外信号调节激酶;PHT：门静脉高压症. ☆☆：P<0.01,t=8.669.肥大作用[4]本实验结果显示 PHT 组脾静脉组织中 AngⅡ水平显著高于对照组，可能是由于 PHT 时门静脉系统的高压力导致局部 RAS 系统激活，致使脾静脉血管局部 AngⅡ合成增多体外试验表明 AngⅡ能明显促进血管平滑肌细胞增殖 [5]因此笔者推测局部 AngⅡ表达增高通过引起血管平滑肌增殖参与了 PHT 的血管病变形成丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinase,MAPK)是生物体内一种重要的信号转导系统，ERK是 MAPK 家族中的成员之一，它能被多种因子激活，主要介导细胞增殖和分化的信号转导[6]研究表明 ERK 激活可能在 VSMC 增殖6过程中起重要作用[7-8]本研究发现 PHT 组脾静脉 ERK 的表达较对照组显著增高提示 ERK 信号传导通路的激活可能与 PHT 的形成和维持密切相关。

局部 AngⅡ升高及 ERK 信号传导通路的激活可能与 PHT 内脏血管病变关系密切，参与 PHT 的形成和维持研究发现 AngⅡ能激活 ERK 信号传导通路，同时 AngⅡ能促进 VSMC 增殖，ERK的特异性抑制剂能抑制 AngⅡ引起的 VSMC 增殖[5,9]提示局部AngⅡ升高可能通过激活脾静脉平滑肌细胞的 ERK 信号传导通路，导致脾静脉血管平滑肌细胞增殖，参与 PHT 血管病变的形成然而AngⅡ如何激活 ERK 信号传导通路仍待进一步试验阐明参考文献】[1] 孙 政,杨 镇 ,徐鋆耀. 局部血管紧张素原的表达与核因子-κB 的活化在门静脉高压症性血管病变中的意义[J]. 中华医学杂志，2005，85(32):2283-2286.[2] 李 涛, 杨 镇. 门脉高压性血管病变研究进展[J]. 世界华人消化杂志，2005，13(1):64-68.[3] 李海洋,杨 镇, 张 彤, 等. 细胞外信号调节激酶 1/2 及 c-fos 在门静脉高压症患者脾静脉壁的表达及意义[J].中华实验外科杂7志, 2005,22(9):1066-1067.[4] Muller D N,Bohlender J,Hilgers K F,et al. Vascular angiotensin converting exzyme expression regulates local angiotensin Ⅱ[J]. Hypertension, 1997,29(1 Pt 1):98-104.[5] Mabrouk M E, Touyz R M， Schiffrin E L. Differential ANG Ⅱ-induced growth activation pathways in mesenteric artery smooth muscle cells from SHR[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2001,281(1):H30-H39.[6] Eguchi S,Iwasaki H,Ueno H,et al. Intracellular signaling of angiotensinⅡinduced p70S6 kinase phosphorylation Ser (411) in vascular smooth muscle cells Possible requirement of epidermal growth factor receptor,Ras, extracelluar signal regulated ki-nases and Akt[J]. J Biol Chem, 1999,274(52):36843-36851.[7] Wang T H，Tan Z，Fu X D，et al. Effect of ERK on 17β-estradiol-induced inhibition of VSMC proliferation in rats after vascular injury[J].Acta Physiol Sin, 2003,55(4)：411-416.8[8] 牟 达, 何 芳,任江林,等. Smad 通路参与 ERK 通路诱导血管平滑肌细胞增殖的过程[J]. 中国病理生理学杂志, 2008,24(4):701-706.[9] Eguchi S,Dempsey P J,Frank G D,et al. Activation of MAPKs by angiotensinⅡ in vascular smooth muscle cells[J]. J Biol Chem, 2001,276(11):7957-7962.。