抗生素体外及体内抑菌效应检测的实验综述报告.docx

抗生素体外及体内抑菌效应检测的实验综述报告1 实验意义本综合实验项目作为微生物学实验的补充和深入，选择抗生 素为实验材料，主要内容包括抗生素的体外抑菌实验、抗生素的 体内抗菌实验，形成一个整体的综合性实验在实验内容上强调 系统性、专业性、实用性和趣味性；涉及微生物学专业多项技术 原理、复杂流程，将整体实验课程的水平从分散的基础实验提升 到综合性、系统性更高的层次，对学生的动手能力、专业水平、 科研素质等进行全面的培养和提高，此即本项目设计的意义所在2 实验目的（1）了解常用抗菌药物的抗菌作用及抗菌范围，并掌握抗 菌药物的某些体外抗菌实验；（2）观察血液、细菌、药物三者相互作用，以加深学生对 抗菌药物药理作用的认识；（3）通过理论联系实际的学习和操作训练，训练学生掌握 医学微生物学综合实验技能和实验技巧，提高动手能力，有助于 学生科学世界观的形成；（4）培养学生独立操作、分析解决问题的能力，提高对微生物学的兴趣，为学生独立创业提供一些创业技能思路3 实验原理金黄色葡萄球菌是机会致病菌，而抗菌药物在一定浓度下对 其有抑制和杀灭作用抗菌药物一般是指具有抑菌或杀菌活性的 药物，包括各种抗生素、磺胺类、咪唑类、硝基咪唑类、喹诺酮 类等化学合成药物。

由细菌、放线菌、真菌等微生物经培养而得 到的某些产物，或用化学半合成法制造的相同或类似的物质，也 可化学全合成药物的体外抑菌实验，是指在体外测定药物抑制或杀灭细菌 能力的实验它是常用抗菌实验的方法，其中最常用的方法有系 列稀释法和琼脂扩散法稀释法有液体培养基连续稀释法和固体稀释法（斜面法）两 种，这两种方法都可以用来测定药物的最小抑菌浓度（MIC）：是 指该药物能抑制细菌生长的最低浓度，通常用？滋 g/mL 或 U/mL 表示其结果判断方法为凡无肉眼可见细菌生长的药物最低浓度 即为该菌的最小抑菌浓度（ MIC）琼脂扩散法是将抗菌药物加至接种试验菌的平板表面，抗菌 药物在琼脂胶内向四周自由扩散，其浓度随扩散距离增大而降低 在药物一定的扩散距离内，由于药物的抗菌效应，试验菌不能生 长，此无菌生长的范围称为抑菌圈抑菌圈的大小与药物的抑菌 效应成正比琼脂扩散法常有纸片法、管碟法、打洞法和挖沟法 一般药敏实验常采用纸片法，我们可以根据抑菌圈的大小，来判 断菌种对药物的敏感性，是敏感，中度敏感还是耐药药物的体内抗菌实验又称为动物实验治疗试验或保护力试 验当抗菌药物进入机体后，其效力的发挥要受体内各种因素的 影响。

如血液及组织内的蛋白质或磷脂、浓汁内的核酸均与药物 结合，降低药物的活性；坏死组织内的酸性环境也能影响药物的 活性机体内的微生物代谢活动较低，对药物的敏感性降低，有 时还可以形成细胞壁缺陷型细菌，对某些药物不敏感机体内各 组织中药物的吸收、分布不同，使药物的浓度难以恒定因此在 评定新药的药效时除做体外抑菌实验外还需要做体内的抗菌实 验4 实验操作4.1 实验材料与用品材料：宿主（兔、鸡等）经抗凝处理后血液全血组分，人工 培养的人单核巨噬细胞U937,金黄色葡萄球菌209-P（或*****5） 标准株器材：灭菌 EP 管（ EP 管）, EP 管架,新鲜全血,枪头（黄、 白、蓝），微量移液器（10?滋L, 100？滋L, 1mL）,灭菌小棉 签，小镊子，圆形滤纸（直径为6 mm）,培养皿，紫外分光光度 计，电热恒温培养箱，恒温振荡培养，细胞培养板药品与试剂：青霉素，链霉素，四环素，氯霉素，红霉素， 碘酊，柠檬酸钠，75%酒精，PBS缓冲液4.2 培养基的制备（1） TSB+agar 培养基：胰蛋白大豆肉汤粉末 30.0g， NaCl 30.0g,蒸馏水 1000mL, pH 7.2,琼脂 20.0g,溶化后分装，121C。

灭菌 15min 备用2） TSB 肉汤培养基：胰蛋白大豆肉汤粉末 30.0g， NaCl30.0g，蒸馏水 1000mL, pH 7.2，121C灭菌 15min 备用4.3 抗菌药物的体外抑菌实验4.3.1 试管法（1） 取灭菌 EP 管 10 只，按 1-10 编号，排列于 EP 管架上 无菌操作，分别加入TSB肉汤培养基0.5mL用微量移液器吸取 40U/mL 的青霉素药液 0.5mL 放入第 1 管，并反复吸匀从第 1 管吸出 0.5mL 放入第 2 管，吸匀后吸出 0.5mL 放入第 3 管，依 此法逐管进行稀释至第 9 管第 10 管不加药液作为对照管2） 各 EP 管加入 0.5mL 新鲜配置的稀释浓度为 10-4 的金 黄色葡萄球菌 209-P 菌液，放入孵箱内于 37C 孵育 24h 后取出， 觀察细菌生长情况并将结果记录于表中细菌不生长的最小浓度 为青霉素对金黄色葡萄球菌的 MIC3） 其余抗菌药物均按上述方法测定对金黄色葡萄球菌209-P 的 MIC4.3.2 纸片法(1) 以灭菌小棉签蘸取金黄色葡萄球菌液，在管壁上旋转 挤压几次，去掉过多的菌液，然后轻轻地从 4 个不同方向平行交 叉划线，使菌液均匀涂布于整个琼脂平板表面。

2) 取2000U/mL的青霉素、2000yg/mL的链霉素、四环 素、氯霉素、红霉素、 2.5%的碘酊各 2 mL 分装于试管中用无菌 小镊子取圆形滤纸 12 张，每两张浸于同一种药液中，浸透后取 出，沥去过多的药液将 2 片含一种药液的滤纸分别放在已接种 细菌的琼脂平板表面的不同区域为了位置间隔准确，最好事先 在皿底用标记笔做上记号3) 将培养皿放入孵箱内于37C孵育24 h,观察纸片周围 有无抑菌圈，将结果记录于表中测量抑菌圈的直径，比较各药 的抗菌效力4.4 抗菌药物的体内抗菌实验4.4.1 接种法及细菌存活测试( 1)金黄色葡萄球菌各菌株划线至 TSB + agar 平板上培养 16h；( 2)从板上挑取多个克隆到含有 PBS 的 EP 管中,离心收集 菌，用PBS洗涤两遍后调菌液浓度至吸光度OD600=0.6，稀释 100 倍后取 100？滋 L 菌液和 lmL 全血混合 37C 摇床培养3）分别在 0h，1h，3h，5h，7h，9h 时间点取 100？滋 L 混合培养液，用无菌水稀释 10 倍、100 倍、1000 倍涂平板，放 置37C培养20 h后，计数生长出来的细菌克隆数，以0 h的克 隆数作为对照，计算存活率，作图。

4.4.2 抗生素體内治疗干预实验（1） 依据步骤 4.3.1 体外抗菌实验的得到的各抗生素的最小 抑菌浓度值，配制各种常用抗生素合适浓度的母液2） 金黄色葡萄球菌各菌株划线至 TSB+agar 平板上培养 16h；（3） 从板上挑取多个克隆到含有 PBS 的 EP 管中，离心收集 菌，用PBS洗涤两遍后调菌液浓度至吸光度OD600=0.6，稀释 100 倍后取 100？滋 L 菌液和 l mL 全血混合，再加入工作浓度的 各种抗生素， 37C 摇床培养4） 分别在 0h， 1h， 3h， 5h， 7h， 9h 时间点取 100？滋 L 混合培养液，用无菌水稀释 10 倍、100 倍、1000 倍涂平板，放 置 37C 培养 20 h 后，计数生长出来的细菌克隆数，以 0 h 的克 隆数作为对照，计算存活率，作图5 注意事项（1）充分灭菌的枪头和 EP 管应当烘干后使用，避免枪头和 EP 管中残余的水株对稀释结果产生影响2）菌液稀释时，确保正确使用移液器，确保吸取的菌液 体积正确3）用移液枪吸取较为粘稠的血液时，动作应当轻柔缓慢， 以免血液进入枪管，影响移液枪使用4）使用灭菌小棉签蘸取金黄色葡萄球菌液涂布琼脂平板 表面时，棉签蘸取菌液后应当在 EP 管壁上碾压一下，避免涂布 后在平板上留下过多菌液，长成较厚菌苔进而影响后期抑菌圈观 察。

5）菌液涂布时，应当在平板上均匀涂布，避免留下空白 区域，影响抑菌圈大小测定6）在进行纸片法测定抑菌效果时，含有抗生素的滤纸片 应当贴在事先划好区域的中央，避免抑菌圈交叉对后续观察实验 的影响7）滤纸片应当轻轻贴附在平板表面，可用无菌的镊子轻 轻按压，切勿造成固体琼脂的破裂和变形，以免影响抑菌圈的大 小和形状8）涂布器在涂布前应当使用酒精灯外焰充分灼烧，在无 菌区内晾凉后进行涂布实验，避免涂布器温度过高烫死细菌，影 响实验数据。