医学细胞生物学：第三章 细胞生物学的研究方法.ppt

第三章 细胞生物学的研究方法 细胞生物学研究的方法细胞的显微结构细胞的亚显微结构细胞每种特殊结构的分子组成及功能结构与功能细胞的生命活动与现象观察细胞的手段与方法细胞组分分离的方法蛋白质分离纯化与鉴定的方法(柱层析，电泳，等）（属于生物化学）分子生物学的方法DNA 操作（PCR， Southern blot，in situ hybridization)RNA 应用(RT-PCR, Northern blot, siRNA)Protein over-expression in a cell细胞培养及细胞分离transformationTransfections(3种）infection要求了解的技术与方法Protein down-expression in a cell (siRNA)蛋白质相互作用的研究技术Co-IPYeast two-hybridization其它生物芯片技术-cDNA microarray蛋白质组学-Mass spectrometry 细胞内分子定位：酶细胞化学技术免疫化学技术放射自显影细胞内分子示踪离子探针GFPFRETDNA 文库，cDNA文库第一节 显微镜技术一.光学显微镜技术（一）普通光学显微镜的分辨率极限是0.2mR=0.61/n*sin（二） 相差显微镜通常用于观察活细胞（三）暗视野显微镜通过散射光成像（四）荧光显微镜可用于特异分子的细胞定位抗体可用于检测特异的分子Primary antibody: rabbit antibodySecondary antibody: goat anti-rabbit IgG免疫绵羊得到抗体纯化后标记吖啶橙荧光染色（血涂片） 吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色 acridine orange/ethidium bromide (AO/EB) （五）共聚焦显微镜可通过虑出不聚集的光从而提供清晰图像（六）显微电影摄影技术能记录细胞或细胞器的运动过程二. 电子显微镜技术光学显微镜的分辨率较低电子显微镜的最高分辨率是0.002nm(理论，实际上不超过0.1nm)生物学标本：2nm（一）投射电子显微镜用于观察细胞的超微结构Specific Macromolecules can be localized by immunogold electron micriscopyMetal shadowing allows surface features to be examined at high resolution by Transmission electron microscopy投射电镜所用的一些方法金属投影法（metal shadowing)冰冻断裂法（freeze-fracture)冰冻蚀刻(freeze-etching)（二）扫描电子显微镜常用于观察生物样品表明的立体结构Different views of a single object can be combined to give a tree-dimensional reconstruction CT (computed tomography)Electron-microscopy (EM) tomography（EMT)第二节 细胞的分离和培养一. 不同类型细胞的分离怎样分离细胞？ 怎样纯化细胞？分离细胞：用胰蛋白酶，EDTA去处理小组织块（从组织水平到细胞水平）关于纯化细胞：（一）差速离心或密度梯度离心（粗分离）（二）流式细胞技术（三）根据细胞表面抗原的情况进行细胞纯化（四）激光捕获显微切割技术二.细胞培养（一）细胞培养的全过程必须在无菌的环境下进行（二） 细胞培养的方式是原代与传代培养（三）来源于体内的细胞可在体外建系细胞系(cell line)细胞株(cell strain)（四）细胞融合可以产生杂交细胞（五）胚胎干细胞可促进医学的革命胚胎干细胞的概念 Embryonic stem cell, ESC 构建基因敲除动物（knockout animal）扩大培养用作基因敲除动物Positive and negative selectionNeoTKXXXneoTK(thymidine kinase)ganciclovir derivativeKill the cell+-第三节 细胞组分的分离和纯化技术（一）差速离心分离体积、质量差别较大的颗粒一. 细胞组分的分级离心（从细胞器水平到分子水平）（二）速度沉降分离沉降系数不同的颗粒（三） 平衡沉降分离密度不同 的颗粒Velocity sedimentationEquilibrium sedimentation 二、层析法分离蛋白质三、蛋白电泳（一）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳依据分子量的不同分离蛋白质（二）等点聚集电泳依据等电点不同分离蛋白质（三） 双向电泳可一次分离数千种蛋白第四节 细胞化学和细胞内分子示踪技术一. 酶细胞化学技术二.免疫细胞化学技术二.免疫细胞化学技术一抗：rb, mouse二抗：羊抗兔，羊抗鼠用兔子IgG去免疫绵羊标记荧光素How can we detect that a protein was made in cells or bacteria ?Western blotProbe（Antibodies specific for some specific proteins ）Steps for Western blot1. Prepare samples, extract protein solution form tissue or culture cells2. Resolve the proteins by SDS-PAGE (SDS- polyacrylamide gel electrophoresis) 3.Transfer the resolved protein into a membrane (PDVF, Nitrocellulose) 4. Blocking 2% BSA (Bovine serum albumin ) or no fat milkTo block the unbinding site of the protein . To eliminate the non specific Binding .5. Detection 1)Primary antibody to recognize the specific protein 2)Secondary antibody labeled with Enzymes, isotope, Fluorescent Most popular used method is Enzyme labeling Alkaline phosphatase and horseradish peroxidase Chemiluminescence Substrate Light expose to a photograph filmDevelop into a bandAvian Leukosis Virus 三. 放射自显影放射自显影技术（autoradiography)3H-亮氨酸，32S-蛋氨酸标记蛋白3H-胸腺嘧啶脱氧核苷、 3H-胸腺、 3H-尿苷标记核酸放射性标记的有丝分裂标记法放射性标记的有丝分裂标记法（percentage labeled mitosespercentage labeled mitoses，PLMPLM）：原理是对测定细胞进行脉冲标记、定时取材、利用放射自显影技术显示标记细胞，通过统计标记有丝分裂细胞百分数(PLM)的办法来测定细胞周期.四. 活细胞内分子示踪（一）离子探针进行细胞内离子的实时检测用钙离子探针观察细胞内钙离子的动态变化（二）绿色荧光蛋白用于显示特定蛋白在细胞内的定位绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP)238 AA450-490nm520nmAdv Rem was used to infect Hep G2 cells Hep G2controlHep G2Infection Adv RemGFP， a report gene1. Monitor plamid existence, therefore, monitor the transfection rate. 2. Monitor gene expression3. Detecting the location of a protein by making GFP fusion proteinGFP fusion proteinExpression of H2B-GFP before and after UV-B-induced apoptosis. A431 cells were stably transfected with H2B-GFP fusion protein (K/H2B-GFP). H2B-GFP is expressed only within the nuclei. In the right panel an apoptotic K/H2B-GFP cell is shown after UV-B irradiation. The “Blebs and bodies forming” phase is shown. Noticeably, redistribution of SLE self antigens are among the remarkable changes that occur during apoptosis. Images were collected in real time by laser confocal microscopy.GFP expression in haematopoietic colonies from transgenic mice carrying the green fluorescent protein (GFP)-reporter gene under the control of Kit (stem cell factor receptor) regulatory elements. These mouse lines provide useful means to mark rare adult multipotential cells which, upon transplantation, can be monitored for their ability to engraft, differentiate and regenerate different tissues. （三）荧光共振能量转移可实时观察细胞内蛋白与蛋白的相互作用荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer, FRET)Cy3-cy5, Alexa546-Alexa647; CFP-YEP, BFP-EGFPB.荧光共振能量转移可实时观察细胞内蛋白与蛋白的相互作用荧光共振能量转移（florescence resonance energy transfer, FRET)Cy3-cy5, Alexa546-Alexa647; CFP-YEP, BFP-EGFPExcitation:402nmemission 475nmExcitation: max395nm和min470nm Emission:509nm B.荧光共振能量转移可实时观察细胞内蛋白与蛋白的相互作用荧光共振能量转移（florescence resonance energy transfer, FRET)Cy3-cy5, Alexa546-Alexa647; CFP-YEP, BFP-EGFPExcitation:402nmemission 475nmExcitation: max395nm和min470nm Emission:509nm 第五节 细胞功能基因组学研究技。