《PCR技术详解》.ppt

PCR技术详解,.,一,二,三,四,五,PCR简史,定义,基本原理,反应要素,PCR的类型,六,PCR反应流程,目录,八,常见问题分析,九,PCR技术应用领域,七,PCR产物检测,.,,,一、PCR简史,1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因 但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了,.,,1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR） 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错，未能推广 1988年，Saiki等人从嗜热杆菌(thermus aquaticus)中提出TaqDNA聚合酶，使得PCR技术得以广泛应用 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖,,.,二、定义 PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外高温（95左右）时变性成单链，低温退火（经常是60左右）时引物与单链按碱基互补配对原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(53)的方向延伸合成互补链,.,三、基本原理 PCR技术模拟DNA 的天然复制过程, 其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物, 该原理主要包括3个基本反应过程：模板变性引物退火新链延伸,.,,,,,,,,,,重复13步 2530轮,目的DNA片段 扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链 与引物复性,DNA变性 形成2条单链,子链延伸 DNA加倍,,.,.,.,理想拷贝数=2n n：循环次数 实际拷贝数=(1+x)n X：平均效率,约为0.85 n：循环次数,.,四、反应要素,,热稳定DNA聚合酶 引物 模板 dNTP 二价阳离子 维持pH的缓冲液,.,热稳定DNA聚合酶,目前有两种Taq DNA 聚合酶供应： 天然酶：从栖热水生杆菌中提纯 基因工程酶：大肠杆菌合成 一个典型的 PCR反应约需酶量 2.5U（指总反应体积为100l时）； 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

2. 引物 引物是PCR特异性反应的关键, PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度；引物浓度一般为0.1-0.5 mol/L，浓度过低影响产量，偏高引起错配和非特异性产物增加，且可增加引物二聚体的产生几率,引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右； 引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb； 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列；,引物设计原则：,.,避免引物内部出现二级结构：避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带； 引物3端的碱基应严格要求配对：特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败； 引物的熔解温度（Tm值），指把DNA的双螺旋结构热变性过程中紫外吸收值达到最大值的1/2时的温度DNA中GC含量越高，Tm值越高，引物对之间的Tm值相差不超过23，经验公式Tm=2(A+T)+4(G+C)，引物的退火温度通常低于Tm值510； 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性； 引物量：每条引物的浓度0.1 0.5M，以最低引物量产生所需要的结果为好 引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会,.,3. 模板,模板即DNA片段, 其量的多少及其纯度的高低, 是PCR成败与否的关键环节之一 单、双链DNA均可 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类 对于哺乳动物基因组DNA开说，每个反应需要的模板量是1g，对于酵母染色体、细菌染色体和质粒等模板的通常用量分别是10ng、1ng、1pg,.,4. dNTP,dNTP在温度较高时容易失活, 因此需要-20下冰冻保存,以保证dNTP的质量。

在PCR反应中, dNTP浓度应为200 250mol/L, 尤其重要的是4种dNTP的体积浓度要相等, 否则就会引起错配 过低浓度降低PCR产量，过高浓度的dNTP(大于4mmol)可能会淬灭Mg2+，从而抑制PCR反应,.,5. 二价阳离子,通常为Mg2+，Mg2+是DNA聚合酶的激活剂，当dNTP浓度为200mol时， Mg2+浓度在1.5mmol/L2.0mmol/L为宜 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性 Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度,.,6.维持pH的缓冲液,室温下pH调到8.38.8的Tris缓冲液常用于PCR反应，浓度在10mmol66mmol，当72时（延伸温度），反应缓冲液的pH会降到约7.2，缓冲液中加入KCl，可以促进引物的退火,.,五、PCR的类型,标准PCR 热启动PCR 反向PCR 巢式PCR LA PCR 不对称PCR RT PCR 实时荧光定量PCR,多重PCR 差异显示PCR 锚定PCR 原位PCR 重组PCR 免疫PCR ,.,1)反向PCR (reverse PCR),是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。

可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组文库已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,,,,,,,,,连接酶,.,2）不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA 方法：采用两种不同浓度的引物分别称为限制性引物和非限制性引物，其最佳比例一般是0.010.5M，关键是限制性引物的绝对量 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究,.,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,高浓度引物,低浓度引物,.,3）多重PCR：在一个反应体系中使用一对以上引物的PCR称为多重PCR其结果是产生多个PCR产物，用于检测特定基因序列的存在或缺失电泳,引物,,,,,,,,.,4）实时定量PCR(real-time PCR): 该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，特定设计的PCR仪器来实时检测PCR扩增过程每一轮循环产物的累积荧光值，可以很好的推算模板的起始浓度,实时PCR技术原理,.,探针设计一般应符合以下条件： 探针长度应在2040个碱基左右，保证结合特异性。

GC碱基含量在40%60%，避免单核苷酸序列的重复 避免与引物发生杂交或重叠 探针与模板结合稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度，因此探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出5 另外，探针的浓度、探针与模板序列的同源性，探针与引物的距离都对实验结果有影响6、PCR反应流程,1、温度与时间的设置,设置变性-退火-延伸三个温度点 标准反应中采用三温度点法，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至4060退火，然后快速升温至7075延伸， 对于较短靶基因（长度100300bp）可采用二温度点法， 将退火与延伸温度合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸 变性温度与时间：,一般9394，1min足以使模板变性 若低于93则需延长时间 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响 退火(复性)温度与时间：,退火温度是影响PCR特异性的重要因素 退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度 对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55作为选择最适退火温度的起点较为理想,在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性,., 延伸温度与时间：,延伸温度：一般选择在7075之间 常用温度为72 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。

延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） 34kb的靶序列需34min 扩增10kb需延伸至15min 延伸时间过长会导致非特异性扩增 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些,.,2、循环次数,循环次数 决定PCR扩增程度 循环次数 主要取决于模板DNA的浓度 循环次数：选在30次左右 循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多,.,七、PCR产物检测,琼脂糖凝胶电泳最常用 聚丙烯酰胺凝胶电泳 层析技术 高效液相色谱（HPLC） 离子交换层析（IEC） 分子杂交 限制性内切酶酶切分析 PCR扩增产物的直接测序,.,八、常见问题分析,不出现扩增条带 分析原因：模板、酶失活或污染、引物对的质量和浓度、PCR产物电泳检测时间一般为48h内 2. 假阳性 分析原因：模板或扩增产物的交叉污染 3. 非特异性扩增带 分析原因：引物与靶序列未完全互补或引物聚合形成二聚体、镁离子浓度过高、退火温度过低、酶不合格或酶量过多 4. 出现片状拖尾或涂抹带 分析原因：模板降解、酶不合格或酶量过多、镁离子浓度过高、退火温度过低、dNTP浓度过高、循环数过多,.,九、PCR技术应用领域,,研究 基因克隆，DNA测序，分析突变 诊断 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 人类基因组工程 遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 法医 犯罪现场标本分析 肿瘤 各种肿瘤检测 其他,.,谢 谢 观 赏,。