实验总结的几种高效酿酒酵母转化方法.docx

电转法设计方案一：感受态制备：1. 挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30°C、250-300rpm培养过夜；2. 取ImL —级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30°C、250-300rpm 培养约 16-18h（OD:1.3-1.5）；3. 于4°C离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤一次后，细胞用10ml冰无菌水 重悬，可换成较小的离心管；4. 加入lml, pH7.5, lOxTE缓冲液，摇晃均匀，再加入lml lOxLiAc，旋转摇 匀，于30度轻轻摇动45min；5. 再加入0.4ml 1 mol/L DTT，并同时旋转摇动，于30度轻轻摇动15min；6. 于4°C离心，弃上清（用枪吸），再用25mL冰无菌水洗涤；7. 2.5ml冰冷的1mol/L山梨醇洗涤，离心收集菌体，弃上清（用枪吸）；8. 每管用100ul山梨醇溶解，分装于EP管中（80ul/管），于-70°C冰箱保存 电转化：1.向感受态细胞中加入约5〜10ug （体积小于10 ul）的DNA，用枪吹吸均匀， 转移至预冷的电转杯中，静置 5min；2•擦干电转杯，电击，电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆；3. 立即加入1ml预冷的山梨醇，转移至EP管中，于30C静置1h；4. 离心，弃上清，加入1mL YEPD后，于30°C、200rpm培养2h；5•离心得菌体后，吸除550 ul上清液，然后按150 ul/板进行涂板。

说明：该方法可直接采用 50 或 100mL 体系的一步法，即直接挑单菌落于 YEPD中培养至预定菌浓，也可采用试管摇菌收集菌体制备感受态设计方案二：感受态制备：1. 挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30°C、250-300rpm培养过夜；2. 取1mL —级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30°C、250-300rpm 培养约 16-18h（OD:1.3-1.5）；3. 于 4C， 5000rpm， 5min 离心收集菌体，用 25mL 冰无菌水洗涤后，细胞重悬 于8ml处理液中（处理液配方:100 mM LiAc，10 mM DTT，0.6 M山梨醇， 10 mM Tris-HCl，pH 7.5），室温静置 30min；4. 4C， 5000rpm， 5min 离心收集菌体，用 1.5mL 1mol/L 预冷的山梨醇洗涤三 次，离心条件一样；5. 每管用100ul山梨醇溶解（以黄枪头能吸取为宜，菌浓低时可适量少加入山 梨醇），最后以80 ul的终体积转移至EP管中（菌体太多可适当放弃部分）, 置于-70 C冰箱保存电转化：1. 向感受态细胞中加入约3ug （体积小于10ul）的DNA，用枪吹吸均匀，转移 至预冷的电转杯中，静置 5min；2. 擦干电转杯，电击，电击参数： 2.0KV， 25uF， 200欧姆；3. 立即加入1ml预冷的山梨醇，转移至EP管中，于30C静置1h；4. 离心，弃上清，加入ImL YEPD后，于30°C、200rpm培养2h；5. 离心得菌体后，吸除550 ul上清液，然后按150 ul/板进行涂板。

说明：处理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT单独 于-20度保存，可配成100倍的贮备液制备体系可按比例放大设计方案二特别适合于采用一步法制备感受态细胞具体如下：1. 挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中或转接于50mL YEPD中，在30C、 250-300rpm条件下培养至OD=6-10 （为防止菌体老化，可将50mL培养体系 提早收获细胞，取菌体时，以1mL/次，取菌两次或三次不等，使用菌浓达到 预定的 OD:6-10）；2. 取1mL菌液分装于EP管中，于4C， 12000rpm离心30s，弃上清；3. 收集菌体，用预冰的无菌水洗涤两次，离心条件一样；4. 所得菌体用1mL处理液（配方同上）于室温下处理30min；5. 离心，弃上清，加入1ml 1M预冷山梨醇，离心，弃上清，重复两次；6. 最终用1M预冷山梨醇溶解菌体至终体积为80 ul，于-70C冰箱保存；7. 电转方法同上8. 每一步的离心均30s即可，在较短的时间内制备出的感受态转化效率特别高备注：OD检测均为600nm，空白参比为：YEPD，高浓测定时应稀释测定所 有无菌水与山梨醇均在冰上预冷处理；在制备感受态阶段，所有离心均在4°C条 件下。

醋酸锂转化法方案一：1. 挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30°C、200rpm培养过夜；2. 取1mL —级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30°C、250-300rpm 培养约 5h（OD:0.5-0.8）；3. 于 4C， 5000rpm， 5min 离心收集菌体；4. 25mL冰无菌水洗涤两次，离心条件一样；5. 用1mL 0.1M LiAc悬浮，离心收集菌体；6. 再用0.5mL 0.1M LiAc悬浮，以50 ul/管分装于EP管中，置于冰上备用；7. 依次向上述50 ul感受态细胞中加入50% PEG3350 : 240ul、lMLiCl： 36ul、 2mg/ml 单链 DNA： 50ul、转化 DNA （5T0ug）： 50ul；8. 剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约 1min）；9. 30C水浴孵育30min；10.42C水浴热休克20〜25min；11.13000rpm离心30s收集酵母菌体，重悬酵母于lml YEPD培养基，30C摇床孵育 4h；12.离心收集沉淀菌体，取除约800 ul上清液，然后按每100 ul/板进行涨涂板。

方案二：1、 接种液体YEPD培养基，过夜培养至1-2x107cells/ml；2、 取1mL —级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30°C、250-300rpm 培养约 5h(OD:0.5-0.8)；3、 收集细胞，并用无菌水清洗，之后用1ml无菌水重悬，并转移到1.5ml离心 管；4、 1mlTE/LiAC (10XTE[0.1 M Tris-HCI,0.01 M EDTA,pH 7.5]； lOXLiAc[1 M LiAc pH 7.5)清洗细胞，然后用 1xTE/LiAC 重悬至 2x109 cells/ml；5、 1.5ml离心管中取50u悬浮液，用1ug转化片段和50ug单链鮭鱼精DNA混 合；6、 加入300ul灭菌的40%PEG溶液，剧烈混匀；7、 30 度振荡培养 30min；8、 42 度水浴热击 15min；9、 离心5s,用1ml 1xTE重悬，适当稀释后涂布于选择培养基附：电转法方案二中的处量液配制方法：1. A 液成份：100 mM LiAc，0.6 M 山梨醇，10 mM Tris-HCl，pH 7.5；配制量： 500mL1.1称取54.654g山梨醇，用适量dd无菌水溶解于500 mL容量瓶中；1.2事先配制1 M LiAc母液，再从LiAc母液中取50mL至1.1所述容量瓶中；1.3事先配好1M Tris-HCl (pH 7.5)，再取5mL至1.1所述容量瓶中；1.4用dd无菌水定量至500mL，转移至试剂瓶中，于4°C保存。

2. B液成份(母液)：1 M DTT 配制量：20mL2.1称取3.09g DTT，加入到50mL小烧杯内；2.2加入20 mL的0.01M NaOAc(pH5.2),溶解后使用0.22um滤器过滤除菌； 2.3适量分成小份后，-20C保存3. 在使用时按每50mL菌体量用8mL处理液(A+B)以50mL菌体为例：取A 液 8mL ，再取 80ul 1 M DTT 于小三角瓶中混匀，备用。