原位杂交技术.docx

原位杂交技术概述■探针 基本步骤概述 核酸的分子结构和特性住核酸的化学组成：嘌吟碱和嘧啶碱戊糖、磷酸DNA 的变性和复性住DNA变性■ 指 DNA 二级结构在加热、改变溶液的 pH 值等，使双螺旋之间的氢 键断裂，双螺旋结构解开，形成单链无规则线团■我们把50%DNA分子解链的温度称为变性温度(Tm)住DNA复性■ 变性的 DNA 在消除变性条件后两条互补链可以重新结合，恢复原来 的双螺旋结构，这一过程称为复性(renaturation核酸分子杂交技术住利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键的形 成，出现稳定的双链区，形成杂交的双链核酸分子杂交液相杂交 固相杂交吸附杂交发光液相杂交液相夹心杂交 复性速率液相杂交菌落原位杂交斑点杂交法Southern 印迹杂交Northern 印迹杂交组织原位杂交1.原位杂交组织化学技术 2 原位杂 交免疫细胞化学技术(其作用方式可大致分为固相杂交和液相杂交两种：液相杂交 是指参加反应的两条核酸链都游离在溶液中，液相分子杂交技术包括 吸附杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复性速率液相分子杂交等 固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上(常用的有硝酸纤 维素滤膜，其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等)，另一条参加反应的核酸链游 离在溶液中。

固相杂交有菌落原位杂交(colony in situ hybridization)、斑点杂交法(Dot blot)、 Southern 印迹杂交(Southern blot)、Northern 印迹杂交(Northern blot)和组织原位杂交(Tissue in situ hybridization),即原位杂交组织化学技术和原位杂交免 疫细胞化学技术)原位杂交组织化学(in situ hybridization histochemistry； ISHH)住原位杂交的本质就是使具有特异序列的单链核酸分子通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位 探针■ 探针(probe)指一种分子，它带有供反应后检测的合适标记物，并仅与特 异靶分子反应抗原-抗体反应，亲和素-生物素、受体-配基以及互补核酸间的 杂交反应■ 核酸探针住指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定核酸序列发生特 异性互补结合的已知核酸序列片段- 探针的分类住按核酸性质不同分DNA探针、cDNA探针、RNA探针、寡核苷酸探针心按所带标记物分同位素标记探针非同位素标记探针DNA探针 住指长度在几百个碱基对以上的双链DNA或单链DNA分子。

这些探针针对某一个基因的全部或部分序列，或者某一非编码序列所以 这些 DNA 片段都必须是特异的■ cDZ/M宋宅十< complementaryDNA ） 扌旨直不卜于*mF^ZA白勺DZA分于cxDZ 车专 Creverse transcrifotase > 彳崔彳七下，LUF^ZA为模板，木艮轴 切或垂互初、西己又寸原贝LI ,扌安照 F^ZA白勺木亥甘曹交序夕I」令归艾白勺DZAH 啟■ RNA探针指具有特定序列的单链RNA分子RNA分子是单链分子，它与靶序列的杂交反应效率极高，但RNA探针容易被RNA酶降解和标记方法复杂寡核苷酸探针：利用寡核苷酸自动合成仪（DNA合成仪），可很简单地合成制备的特定序列的寡核苷酸链（如15〜50bp）■探针的选择：在大多数情况下，可以选择克隆的 DNA 或 cDNA 双链探针在有些情况下，■必须选用其它类型的探针如寡核苷酸探针和RNA探针 优点 灵敏度高 特异性高 方法简便■缺点 半衰期短 费用高 检测时间长 放射性污染■学修饰标记法■探针的标记方法 放射性标记 非放射性标记 酶促反应标记法 化 酶促反应标记 缺口平移法 随机引物法 末端加尾法化学修饰法是将不同的标记物用化学方法连接到DNA分子上。

如光敏生物素标记核酸方法，只要光照10-20min,生物素就可以结合在DNA或RNA分子上■ 切口平移法住原理：DNA酶I在Mg2+离子存在时，能在双链DNA的各股单链的不同位 置上造成随机切口，然后在存在着一种已标记dNTP底物进行5'—3'修复合成，在这个 反应过程中将已标记的 dNTP 合成进 DNA 链中■ 随机引物合成法住用一些随机引物和探针DNA片段一起加热变性，退火后，引物与单链DNA互补结合，再在大肠杆菌聚合酶 I 的作用下，按碱基互补配对的原则不断在其3'端添加标记 的单核苷酸修补缺口，合成新的探针片段■ 末端标记法该标记方法标记的是线性 DNA 或 RNA 的 5'端或 3'端 5'端标记时，先用碱性磷酸酶切除5'端的磷酸基团，然后用 T4 多聚核苷酸激酶催化标记 的ATP连接到DNA片段5'端，从而使DNA片段成为标记探针；3'端标记时，用未端转移酶催化已标记的 dNTP 加到寡核苷酸的 3'端，成为标记探针； 未端标记法常用来进行各种放射性探针的标记■ 常用非放射性标记物 生物素 光敏生物素 异羟基洋地黄毒甙 （Digoxigenin,地高辛） 光敏2，4-二硝基苯（光敏DNP） 三硝基苯磺酸（TNBS）等杂交条件- 探针的浓度:最佳原则是应用最低探针浓度以达到与靶核苷酸的最大饱和结合度为目的 加杂交液的量要适当，一般10-20 “ l每张切片为宜。

■ 探针长度：一般应用于ISHH探针的最佳长度应在50-100个碱基之间， 探针短易于进入细胞，杂交率高，杂交时间短■ 杂交率：在探针过量的条件下，杂交率主要依赖于探针长度（复杂度）和 探针浓度■ 杂交温度的选择 最适复性温度（Optimunm renaturation temperature, TOR）： Tor =Tm-25°C，苛刻复性温度：Ts = Tm- （10或15°C）,非苛刻复性温度：Tns =Tm -（30或35°C）注:杂交的程序中常规的加入30%〜50%甲酰胺于杂交液中，每增加1%的 甲酰胺浓度，Tm值可降低0.72C同时可以用调节盐浓度的办法来调节Tm■ 杂交反应时间 一般杂交反应要进行20h左右■ Cot = CoX t Co：杂交液中单链起始浓度；t：反应时间Cot =100时， 杂交反应基本完成Cot=0，基本上没有杂交■ 杂交促进剂 惰性多聚体可用来促进250个碱基以上的探针的杂交率1•硫酸葡聚糖（一种广泛用于较长双链探针杂交的促进剂2•聚乙二醇（PEG）（分子量小、 粘度低、价格低廉3.聚丙烯酸（用其钠盐，浓度为 2%〜4%与硫酸葡聚糖相比：其优 点是价格低廉，粘度低。

4•酚和硫氰酸胍原位杂交的基本步骤固定、取材、玻片和组织的处理 杂交 杂交后的处理 显示（经典的原位杂交技术包括载玻片处理，组织细胞的固定，探针的制备或选购，原位杂交， 洗涤以及检测，其中探针制备技术不属于本章专业技术，故不作具体评叙）固定原位杂交固定的目的是为了保持细胞形态结构；最大限度地保存细胞内的DNA或RNA的 水平；使探针易于进入组织多聚甲醛固定醋酸+酒精的混合液和Bouinz s固定剂也能获得较满意的效果组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片后才将其浸入4%多聚甲醛约10 min,空气干燥 后保存在-70 °C固定剂的应用和选择上应兼顾到三个方面：1保持细胞结构，2最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；3使探针易于进入细胞或 组织最常用的是多聚甲醛，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探 针穿透入细胞或组织沉淀性（Precipitating）固定剂：醋酸酒精的混合液和Bouin's固定剂能为增加核酸探针 的穿透性提供最佳条件，但它们不能最大限度地保存RNA,而且对组织结构有损伤组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片后才将其浸入4%多聚甲醛约10min，空气干 燥后保存在-70C。

如冰箱温度恒定，在-70C可保存数月之久不会影响杂交结果在病理 学活检取材多用福尔马林固定和石蜡包埋，这种标本对检测DNA和mRNA有时也可获 得杂交信号，对于mRNA的定位，我们常采用的方法是将组织固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中 1〜2h，在冷冻前浸入15%蔗糖溶液中，置4°C冰箱过夜，次日切片或保存在液氮中待恒 冷箱切片机或振荡切片机切片石蜡包埋切片由于与蛋白质交叉连接的增加，影响核酸探针的穿透，因而杂交信号 常低于冰冻切片同时，在包埋的过程中可减低mRNA的含量各种固定剂均有各自优缺点，但至今，多聚甲醛仍被公认为 ISHH 较为理想的固定剂)玻片和组织切片的处理玻片的处理1. 玻肥皂水刷洗，自来水洗净，置于清洁液中浸泡24 h,烘干，95%酒精中浸泡24 h后蒸 馏水冲洗、烘干、烘箱温度最好在150°C或以上过夜以去除任何RNA酶盖玻片在有条件 时最好用硅化处理，锡箔纸包裹无尘存放2. 铬矾明胶，多聚赖氨酸包被片子增强组织的通透性和核酸探针的穿透性1稀释的酸洗涤2去垢剂(detergent)或称清洗剂TritonX-100、3酒精4消化酶如蛋白酶K, 胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉酶(diastase)等减低背景染色1预杂交(Prehybridizaiton)2杂交后(Posthybridization)3酶处理和洗涤其它方法 (1.将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，从而减低背景。

2.采用 低浓度的RNA酶溶液(20 “gml)洗涤一次，以减低残留的内源性的RNA 3.多聚甲醛固 定后，浸入乙酸酐和三乙醇胺中，减低静电效应，减少探针对组织的非特异性背景染色■ 防止RNA酶的污染1戴消毒手套2高温(>150C)烘烤所有实验用玻璃 器皿及镊子以达到消除 RNA 酶的目的杂交杂交(Hybridsation)■ 杂交是将杂交液滴于切片组织上，加盖硅化的盖玻片，或采用无菌的蜡膜 代替硅化的盖玻片，加盖片防止孵育过程中杂交液的蒸发■ 杂交后处理(Post hybridisation treatment)杂交后处理包括系列不同浓度，不 同温度的盐溶液的漂洗一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高显示 Visualization)1 放射自显影2 酶检测系统进行不同显色处理。