抗生素微生物检定管碟法在中国药典2005版的应用及操作要点.docx

抗生素微生物检定法可分为：（1）稀释法；（2）比浊法；（3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价    管碟法：利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈    此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价    原理：利用抗生素在固体培养基中的平面扩散作用，依据量反应平行线原理并采用交叉实验设计方法，在相同实验条件下通过比较标准品（已知效价）和供试品两者对所接种试验菌产生的抑菌圈（直径或面积）大小，来测定供试品效价的一种方法管碟法的操作步骤：    1、 预试验：确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定：一剂量法中心点的抑菌圈直径应在 16～17.5mm，二剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在 15～18mm    2、试验准备：双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。

    3、双碟的制备：每只双碟加底层培养基约20ml，待培养基凝固后，将双碟放入35～37℃培养箱中，待用    4、供试品、标准品溶液的制备：估计供试品的效价，根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液    5、菌层的制备：注意菌层培养基温度；根据预试验确定加入菌层培养基的菌液量，注意制备菌层的速度和平整度    6、滴加抗生素溶液：注意标准品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序，保证滴加速度和加量的均匀一致    7、双碟的培养：根据培养温度的要求在培养箱中进行培养，培养箱中水平碟放的双碟数以不超过三层为宜    8、抑菌圈的测量：抑菌圈测量仪的使用，每组试验双碟应在相同的测量参数下进行测量手工测量：游标卡尺    9、结果的可靠性检验及效价测定：抑菌圈测量仪提供计算结果或手工计算结果操作要点    第一步一般应制成500或1000单位/毫升的溶液，以后逐步稀释至供试浓度的溶液，稀释步骤应为3～4步    溶解：对于需用乙醇溶解的样品，由于溶解样品时所用乙醇量较大，加灭菌水后溶液放热，因此需充分摇匀后加灭菌水至接近容量瓶刻度，待冷至室温后再稀释至刻度。

    标准品溶液与供试品溶液浓度的比值D应控制在±5%以内，以保证两者浓度的偏差在一定范围内    试验菌的菌龄对抑菌圈有一定影响故检定时应保持菌种及菌液的新鲜    一般菌种一月转种一次，冰箱冷藏保存对易变异的菌株，如藤黄微球菌等在制备菌悬液前进行单菌分离；其他菌株可半年分离一次    试验菌传代最好不超过5次，以防止菌种老化变异芽孢杆菌培养物用灭菌水洗下后，应在65℃加热30分钟，使菌体的菌龄一致，用革兰氏染色，应有芽孢85%以上    加 入菌悬液的体积，一般不少于0.3ml，并且不大于上层培养基体积的2%如果加入菌悬液的体积过小，则在同次实验中，不同次加入菌悬液的体积相差较大， 造成实验误差；如果加入菌悬液的体积过大，则会使上层培养基变稀，并且因菌悬液的温度较低，加至培养基中可能造成培养基结块，影响测定结果对于加入菌悬 液体积的控制，可通过调节菌悬液的浓度来实现    在制备菌层培养基时，将菌液加入菌层培养基后，立即充分摇匀，但应避免产生气泡    加入芽孢悬液时，菌层培养基的温度为65℃，对非芽孢悬液时，菌层培养基的温度一般为48～50℃    放置孵箱培养时排放应不得超过三层，避免因培养温度不均匀而导致各双碟中抑菌圈大小不一。

    抗 生素原料药：不含辅料的药物制剂原料，一般其效价以纯度（u/mg或µg/mg）表示检验时，可参考该品种的药品标准纯度限度规定或厂方提供的纯度估计 效价，取样试验，如估计效价与实际效价相差较远时，即测定所得效价超出估计效价的±10%时，则重新估计效价，再做准确测定    粉针剂：指注射用无菌粉末或冻干品，用西林瓶橡胶塞铝盖封装或熔封在安瓶内，一般测定其纯度（u/mg或µg/mg）或整瓶效价    取装量差异项下的内容物，称取适量（50mg以上，根据标示量及平均装量折算估计效价，并按估计效价及量瓶体积计算取样量），置量瓶中，加标准中规定的溶剂溶解，稀释，测定，计算出1mg的效价单位数，再根据平均装量及标示量计算平均每瓶的百分含量水针剂（注射液）：即抗生素的灭菌水溶液，标示量一般按每毫升含效价单位计    效 价测定时，量取平均装量项下的内容物或5～10支的内容物，混匀，用干燥的刻度吸管吸取一定量的供试品，将吸管外壁用滤纸拭净，再弃去多余的溶液，使供试 品至吸管刻度，沿量瓶颈部内壁缓缓流入已盛有一定量溶剂（以免抗生素结晶析出）的量瓶内，混匀，继续加溶剂至刻度，摇匀，再量取适量稀释至规定的浓度。

    素片、薄膜衣片：称取20片的总量，求出平均片重，研细混匀后，精密称取适量（约相当于1片的重量或根据标示量按平均片重及所用量瓶体积折算取样量），置量瓶中，用标准中规定的溶剂溶解，并稀释至刻度，摇匀再量取适量稀释至规定浓度    注 意点：研磨时应注意环境干燥，可在干燥操作柜内操作，研磨要迅速，避免吸湿，因片剂内含辅料较多，辅料可能漂浮于溶液表面，稀释时量取供试溶液应读取辅料 下层的溶液切面；如沉淀较多，须待其下沉后再量取上层液；有些辅料吸附抗生素，应加以注意为节约供试品，可与重量差异检查结合进行    糖 衣片、肠溶片：取标准中规定的片数，置于乳钵中，研细，分次加入规定的溶剂，研磨使其溶解，将研磨液转移至瓶口放有小漏斗的量瓶中，量瓶体积根据供试品标 示量、所取片数及抗生素储备液浓度（一般为1000单位/ml）选定，用规定溶剂稀释至刻度，摇匀，静置，使辅料下沉而抗生素已溶解在溶液内，精密吸取量 瓶中的上层液适量，作进一步稀释个别品种标准如同时收载了糖衣片和薄膜衣片，可能规定薄膜衣片也取整片制备供试溶液    胶囊剂：取装量差异项下的内容物，混合均匀，研细，根据平均装量，精密称取约相当于1粒胶囊的量或按标示量、量瓶体积及抗生素储备液浓度等计算的取样量，置于量瓶中，加规定的溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，如供试品含有较多的辅料，则照片剂项下的方法进行。

    颗 粒剂、干混悬剂：取装量差异项下的内容物，混匀，根据平均装量，精密称取约相当于1袋（包）的量或按标示量、量瓶体积及抗生素储备液浓度等计算的取样量， 置于量瓶中，加规定的溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀量取适量稀释制成供试品溶液测得效价后，再根据装量差异项下的平均装量，计算出平均每袋（包）的效 价，根据标示量即可算出含量    软膏剂、眼膏剂：擦净软膏剂或眼膏剂软管的外壁，切开封口，置于干燥器内约1小时，取干燥的洁净分液漏斗， 带手套操作，将膏剂软管连同内容物在天平上称重，取出，将内容物挤入分液漏斗，量约2g，再称取膏剂软管的重量，按减重法以前后称量之差计算分液漏斗内膏 剂供试品的量，以不含过氧化物的乙醚或石油醚等作溶剂溶解基质，但基质中的抗生素则应不溶于或几乎不溶于该有机溶剂中，以避免提取过程中抗生素的损失按 标准中的规定加提取溶剂至分液漏斗中，振摇，使基质溶解，用规定的缓冲溶液提取抗生素至水相中，用缓冲溶液提取3次，合并3次的提取液，置量瓶中，加缓冲 溶液至刻度，依法操作，计算效价实验要点    磷霉素钠，磷霉素钙，磷霉素氨丁三醇    主要问题：抑菌圈偏小    解决：1. pH9.0抗Ⅱ号培养基（pH7.8～8.0）2. 滴加药液后，室温放置1小时后，放入孵箱内培养。

3. 培养时间以24小时为宜，培养时间短，抑菌圈清晰度不好，培养24h后如抑菌圈仍不清晰，应室温放置一段时间待清晰后再测量啤酒酵母菌的培养    主要问题：生长不良    CP2005：抗Ⅴ号琼脂斜面及抗Ⅳ琼脂斜面    解决：1. 采用沙氏或YPD酵母菌培养基；2. 32～35℃培养24小时    沙氏培养基蛋白胨10g 葡萄糖40g琼脂13g 水1000ml调节灭菌后pH5.4～5.8    YPD培养基蛋白胨10g 葡萄糖40g酵母粉5g 琼脂13g水1000ml管碟法特点：    优点：基本操作和设计适用于各种抗生素，试验结果较稳定；样品用量少，灵敏度高；适合于大批样品的测定    缺点:凡具有抗菌活性的物质都会干扰测定结果；试验过程长，需第二天才有结果；操作手工化，需熟练人员才能得到较正确的结果；受扩散因素的影响，如培养基原材料的质量，一般琼脂中的杂质可能影响扩散速度及效价强度管碟法抗生素效价测量管碟法抗生素效价测量 - 简介抗生素的生物检定是以抗生素对微生物的抗菌效力作为效价的衡量标准，具有与应用原理相一致、用量少和灵敏度高等优点管碟法是琼脂扩散法中的一种，已被各国药典广泛采用，作为法定的抗生素生物检定方法。

管碟法抗生素效价测量 - 原理当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低因此，当抗生素浓度达到或高于 MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系北 京潮声公司具有同行业的领先水平在管碟法抗生素效价测量实验中需要注意的影响因素分析及对策如下：管碟法是 国内外常用的抗生素微生物检定法【1】，利用管碟法测定抗生素效价，具有准确、直观、重复性好等优点，因而被广泛采用但是整个试验过程中影响结果的因素 很多，任何一个环节操作不当或者忽略就会造成很大误差，导致整组试验失败根据实际操作中的积累经验，对管碟法中影响试验结果的因素进行如下分析及提出解 决的方法 管碟法抗生素效价测量 - 实验 1. 实验器材的准备1.1 实验器材的选择试 验应该选择底面平整的玻璃双碟，避免底面的凹凸影响琼脂层的厚度可将双碟放置在水平台上，下垫一层白纸，加入3mL水，再滴加蓝墨水，根据蓝色是否深浅 一致来判断双碟底面平整程度小钢管则应该选择加工精细的同一批产品，这样才能保证管壁厚薄与重量均匀一致，使得小钢管在培养基中下陷相同的深度，抗生素 溶液扩散均匀有可比性。

如果小钢管两端不够平，就应予剔除，否则会使抗生素溶液漏出，破坏均匀扩散现象1.2 实验器材的清洗抗 生素试验中，玻璃双碟、小钢管往往会连续使用由于清洗方面的原因，它们还是容易残留上次试验中的抗生素（庆大霉素、争光霉素、链霉素等）或者被清洗用的 杀菌剂（如新洁而灭、洗洁精、去污粉等）污染，以至于在下次试验中造成抑菌圈不正常的现象因此，在清洗时要尤为注意多用流水冲洗160℃干热灭菌2h 后备用2. 配制试验所需的样品、标准品、缓冲液与培养基2.1 样品与标准品溶液的配制标 准品与样品从冰箱取出后，使与室温平衡供试品应放于干燥器内至少30min方可称取称量最好为一次取样称量，动作迅速，不得反复称取，取样后立即将称 量瓶瓶盖盖好，以免吸水标准品的称量最好用1/100,000克的分析天平，样品称量不得低于1/10,000克的分析天平天平中的干燥剂应保持经常 注意更换称量结束后，加入超声波处理后的磷酸缓冲液，定容至刻度，过滤并稀释稀释时，都应采用容量瓶，每一步稀释取样量不得少于2mL用刻度吸管吸 取溶液前，要用待稀释液冲洗吸管2～。