高效液相色谱法相关参数测定.ppt

高效液相色谱分析法高效液相色谱分析法High performance liquid chromatography一、液相色谱仪器一、液相色谱仪器二、二、高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点 特点：高压、高效、高速特点：高压、高效、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法三、流程及主要部件三、流程及主要部件(1) 高压输液泵高压输液泵 A、、主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：150～～350×105 Pa B、、为为了了获获得得高高柱柱效效而而使使用用粒粒度度很很小小的的固固定定相相（（<10μm）），， 液液体体的的流流动动相相高高速速通通过过时时，，将将产产生生很很高高的的压压力力，，因因此此高高压压、、高速是高效液相色谱的特点之一高速是高效液相色谱的特点之一C、、应应具具有有压压力力平平稳稳、、脉脉冲冲小小、、流流量量稳稳定定可可调调、、耐耐腐腐蚀蚀等等特特性性(2)梯度淋洗装置梯度淋洗装置外梯度外梯度: 利用两台高压输液利用两台高压输液泵，将两种不同极性的泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进梯度混合室，混合后进入色谱柱。

入色谱柱内梯度内梯度: 一台高压泵一台高压泵, 通过通过比例调节阀比例调节阀,将两种或将两种或多种不同极性的溶剂多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高按一定的比例抽入高压泵中混合压泵中混合(3) 进样装置进样装置 流路中为高压力工作状态，流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置，通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：其结构如图所示：(4) 高效分离柱高效分离柱 柱体为直型不锈钢管，内径柱体为直型不锈钢管，内径1～～6 mm，，柱长柱长5～～40 cm发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效 a. 紫外检测器紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应应用最广，对大部分有机化合物有响应 特点：特点： 灵敏度高；灵敏度高； 线形范围高；线形范围高； 流通池可做的很小（流通池可做的很小（1mm × 10mm ，，容积容积 8μL）；）； 对流动相的流速和温度变化不敏感；对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作；波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。

可用于梯度洗脱 (5) 液相色谱检测器液相色谱检测器b. b. 光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器 光电二极管阵列检测器：光电二极管阵列检测器： 1024个个二二极极管管阵阵列列，，各各检检测测特特定定波波长长，，计计算算机机快快速速处处理理，，三维立体谱图，如图所示三维立体谱图，如图所示光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器 除紫外检测器之外应用最多的检测器；除紫外检测器之外应用最多的检测器； 可可连连续续检检测测参参比比池池和和样样品品池池中中流流动动相相之之间间的的折折光光指指数数差差值差值与浓度呈正比；值差值与浓度呈正比； 通通用用型型检检测测器器（（每每种种物物质质具具有有不不同同的折光指数）；的折光指数）； 灵灵敏敏度度低低、、对对温温度度敏敏感感、、不不能能用用于于梯梯度洗脱；度洗脱； 偏偏转转式式、、反反射射式式和干涉型三种；和干涉型三种；c. 示差折光检测（示差折光检测（Differential refractive index detector））示差折光检测器示差折光检测器d. 荧光检测器荧光检测器（Fluorescence detector） 高灵敏度、高选择性；高灵敏度、高选择性； 对对多多环环芳芳烃烃，，维维生生素素B、、黄黄曲曲霉霉素素、、卟卟啉啉类类化化合合物物、、农农药药、、药药物物、、氨氨基基酸酸、、甾甾类类化合物等有响应；化合物等有响应；主要分离类型与原理主要分离类型与原理一、一、 液液-固吸附色谱固吸附色谱 (Liquid-solid adsorption chromatography) 固固定定相相：固固体体吸吸附附剂剂为为，，如如硅硅胶胶、、氧氧化化铝铝等等，，较较常常使使用的是用的是5～～10μm的硅胶吸附剂；的硅胶吸附剂； 流动相流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。

各种不同极性的一元或多元溶剂 基本原理基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 适适用用于于分分离离相相对对分分子子质质量量中中等等的的油油溶溶性性试试样样，，对对具具有有官能团的化合物和异构体有较高选择性；官能团的化合物和异构体有较高选择性； 缺点缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；非线形等温吸附常引起峰的拖尾；二、二、 液液-液分配色谱液分配色谱liquid- liquid partition chromatography 固定相与流动相均为液体（互不相溶）；固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；组分在固定相和流动相上的分配； 流流动动相相：对对于于亲亲水水性性固固定定液液，，采采用用疏疏水水性性流流动动相相，，即即流流动动相相的的极极性性小小于于固固定定液液的的极极性性（（正正相相 normal phase）），，反反之之，，流流动动相相的的极极性性大大于于固固定定液液的的极极性性（（反反相相 reverse phase））。

正正相与反相的出峰顺序相反；相与反相的出峰顺序相反； 固定相固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化化学学键键合合固固定定相相：（（将将各各种种不不同同基基团团通通过过化化学学反反应应键键合合到硅胶（担体）表面的游离羟基上到硅胶（担体）表面的游离羟基上C-18柱（反相柱）柱（反相柱）三、三、 离子交换色谱离子交换色谱(Ion-exchange chromatography) 固定相固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 流流动动相相：阴阴离离子子离离子子交交换换树树脂脂作作固固定定相相，，采采用用酸酸性性水水溶溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液； 基基本本原原理理：：组组分分在在固固定定相相上上发发生生的的反反复复离离子子交交换换反反应应；；组组分分与与离离子子交交换换剂剂之之间间亲亲和和力力的的大大小小与与离离子子半半径径、、电电荷荷、、存存在形式等有关。

亲和力大，保留时间长；在形式等有关亲和力大，保留时间长； 阳离子交换：阳离子交换：R—SO3H +M+ = R—SO3 M + H + 阴离子交换：阴离子交换：R—NR4OH +X- = R—NR4 X + OH- 应用应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等四、四、 离子色谱离子色谱(Ion chromatography) 离离子子色色谱谱是是在在20世世纪纪70年年代代中中期期发发展展起起来来的的一一中中技技术术，，其其与与离离子子交交换换色色谱谱的的区区别别是是其其采采用用了了特特制制的的、、具具有有极极低低交交换换容容量量的的离离子子交交换换树树脂脂作作为为柱柱填填料料，，并并采采用用淋淋洗洗液液抑抑制制技技术术和和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法 五、五、 离子对色谱离子对色谱(Ion pair chromatography) 原原理理：将将一一种种（（或或多多种种））与与溶溶质质离离子子电电荷荷相相反反的的离离子子（（对对离离子子或或反反离离子子））加加到到流流动动相相中中使使其其与与溶溶质质离离子子结结合合形形成成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配； 阴阴离离子子分分离离：常常采采用用烷烷基基铵铵类类，，如如氢氢氧氧化化四四丁丁基基铵铵或或氢氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；氧化十六烷基三甲铵作为对离子； 阳阳离离子子分分离离：常常采采用用烷烷基基磺磺酸酸类类，，如如己己烷烷磺磺酸酸钠钠作作为为对对离子；离子； 反反相相离离子子对对色色谱谱：非非极极性性的的疏疏水水固固定定相相(C-18柱柱)，，含含有有对对离离子子Y+的的甲甲醇醇-水水或或乙乙腈腈-水水作作为为流流动动相相，，试试样样离离子子X-进进入入流动相后，生成疏水性离子对流动相后，生成疏水性离子对Y+ X -后；在两相间分配。

后；在两相间分配六、六、 排阻色谱色谱排阻色谱色谱(Size- exclusion chromatography) 固定相固定相：凝胶凝胶(具有一定大小孔隙分布具有一定大小孔隙分布)；； 原原理理：：按按分分子子大大小小分分离离小小分分子子可可以以扩扩散散到到凝凝胶胶空空隙隙，，由由其其中中通通过过，，出出峰峰最最慢慢；；中中等等分分子子只只能能通通过过部部分分凝凝胶胶空空隙隙，，中中速速通通过过；；而而大大分分子子被被排排斥斥在在外外，，出出峰峰最最快快；；溶溶剂剂分分子子小小，，故在最后出峰故在最后出峰 全部在死体积前出峰；全部在死体积前出峰； 可可对对相相对对分分子子质质量量在在100-105范围内的化合物按质量分离范围内的化合物按质量分离 七、七、 亲和色谱亲和色谱(AC)( Affinity chromatograph) 原原理理：利利用用生生物物大大分分子子和和固固定定相相表表面面存存在在的的某某种种特特异异性性亲和力，进行选择性分离亲和力，进行选择性分离 先先在在载载体体表表面面键键合合上上一一种种具具有有一一般般反反应应性性能能的的所所谓谓间间隔隔臂臂(环环氧氧、、联联胺胺等等)，，再再连连接接上上配配基基(酶酶、、抗抗原原等等)，，这这种种固固载载化化的的配配基基将将只只能能和和具具有有亲亲和和力力特特性性吸吸附附的的生生物物大大分分子子作作用用而而被被保留。

改变淋洗液后洗脱改变淋洗液后洗脱液相色谱的固定相与流动相液相色谱的固定相与流动相一、液相色谱固定相一、液相色谱固定相 Stationary phases of LC 1. 1. 液液- -液分配及离子对分离固定相液分配及离子对分离固定相 （（1）全多孔型担体）全多孔型担体 由由氧氧化化硅硅、、氧氧化化铝铝、、硅硅藻藻土土等等制制成成的的多多孔孔球球体体；；早早期期采采用用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见； 现采用现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；以下的小颗粒，化学键合制备柱填料； （（2）表面多孔型担体）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体）（薄壳型微珠担体） 30～～40μm的的玻玻璃璃微微球球，，表表面面附附着着一一层层厚厚度度为为1 ～～ 2μm的的多孔硅胶多孔硅胶 表面积小，柱容量底；表面积小，柱容量底；（（3）化学键合固定相）化学键合固定相 化学键合固定相化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相；目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型：硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；； c. 硅碳键型：硅碳键型： ≡Si—C d. 硅氮键型：硅氮键型： ≡Si—N化学键合固定相的特点化学键合固定相的特点（（1））传质快传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（（2））寿命长寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击； 耐水、耐光、耐有机溶剂，耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定稳定；； （（4））选择性好选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；，可键合不同官能团，提高选择性；（（5））有利于梯度洗脱；有利于梯度洗脱； 存在着存在着双重分离机制双重分离机制：：(键合基团的覆盖率决定分离机理键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：分配为主；高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；低覆盖率：吸附为主；  种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等； 结构类型：全多孔型和薄壳型；结构类型：全多孔型和薄壳型； 粒度：粒度：5～～10 μm；； 3.3.离子交换色谱离子交换色谱分离固定相分离固定相 结构类别：结构类别：（（1）薄壳型离子交换树脂）薄壳型离子交换树脂 薄薄壳壳玻玻璃璃珠珠为为担担体体，，表表面涂约面涂约1%的离子交换树脂；的离子交换树脂；（（2）离子交换键合固定相）离子交换键合固定相 薄薄壳壳键键合合型型；；微微粒粒硅硅胶胶键合型（键合离子交换基团）键合型（键合离子交换基团） 树脂类别：树脂类别：（（1）） 阳阳离离子子交交换换树树脂脂（（强强酸酸性、弱酸性）性、弱酸性）（（2）） 阴阴离离子子交交换换树树脂脂（（强强碱碱性、弱碱性）性、弱碱性） 4. 4. 空间排阻分离固定相空间排阻分离固定相（（1）软质凝胶）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。

多孔网状结构；葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等多孔网状结构； 水为流动相适用于常压排阻分离水为流动相适用于常压排阻分离2）半硬质凝胶）半硬质凝胶 苯乙烯苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶； 非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂（（3）硬质凝胶）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等；多孔硅胶、多孔玻珠等； 化化学学稳稳定定性性、、热热稳稳定定性性好好、、机机械械强强度度大大，，流流动动相相性性质质影影响响小，可在较高流速下使用小，可在较高流速下使用 可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布二、液相色谱的流动相二、液相色谱的流动相 mobile phases of LC 1. 1. 流动相特性流动相特性 （（1））液液相相色色谱谱的的流流动动相相又又称称为为：：淋淋洗洗液液，，洗洗脱脱剂剂流流动动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况； （（2））亲亲水水性性固固定定液液常常采采用用疏疏水水性性流流动动相相，，即即流流动动相相的的极极性性小小于于固固定定相相的的极极性性，，称称为为正正相相液液液液色色谱谱法法，，极极性性柱柱也也称称正正相柱。

相柱 （（3））若若流流动动相相的的极极性性大大于于固固定定液液的的极极性性，，则则称称为为反反相相液液液液色色谱谱，，非非极极性性柱柱也也称称为为反反相相柱柱组组分分在在两两种种类类型型分分离离柱柱上上的出峰顺序相反的出峰顺序相反 2. 2. 流动相类别流动相类别 按流动相组成分按流动相组成分：单组分和多组分；单组分和多组分； 按极性分按极性分：极性、弱极性、非极性；极性、弱极性、非极性； 按使用方式分按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗固定组成淋洗和梯度淋洗 常常用用溶溶剂剂： 己己烷烷、、四四氯氯化化碳碳、、甲甲苯苯、、乙乙酸酸乙乙酯酯、、乙乙醇醇、、乙腈、水乙腈、水 采采用用二二元元或或多多元元组组合合溶溶剂剂作作为为流流动动相相可可以以灵灵活活调调节节流流动动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间3. 3. 流动相选择流动相选择 在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据 采用正相液采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。

若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短保留时间缩短 常用溶剂的极性顺序常用溶剂的极性顺序： 水水(最大最大) > 甲酰胺甲酰胺> 乙腈乙腈> 甲醇甲醇> 乙醇乙醇> 丙醇丙醇> 丙酮丙酮> 二氧六环二氧六环> 四氢呋喃四氢呋喃> 甲乙酮甲乙酮> 正丁醇正丁醇> 乙酸乙酯乙酸乙酯> 乙醚乙醚> 异丙醚异丙醚> 二氯甲烷二氯甲烷>氯仿氯仿>溴乙烷溴乙烷>苯苯>四氯化碳四氯化碳>二硫化碳二硫化碳>环己烷环己烷>己烷己烷>煤油煤油(最小最小)4. 4. 选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题（（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加积损坏色谱柱和使检测器噪声增加2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定柱子如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。

相等3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积淀并在柱中沉积4）流动相同时还应满足检测器的要求当使用紫外）流动相同时还应满足检测器的要求当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收检测器时，流动相不应有紫外吸收影响分离的因素与操作条件的选择影响分离的因素与操作条件的选择一、一、影响分离的因素影响分离的因素 factors influenced separation1. 1. 影响分离的因素与提高柱效的途径影响分离的因素与提高柱效的途径• 在在高高效效液液相相色色谱谱中中, 液液体体的的扩扩散散系系数数仅仅为为气气体体的的万万分分之之一一，，则速率方程中的分子扩散项则速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，即：较小，可以忽略不计，即：H = A + C u故液相色谱故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示曲线与气相色谱的形状不同，如图所示• 液液体体的的黏黏度度比比气气体体大大一一百百倍倍，，密密度度为为气气体体的的一一千千倍倍，，故故降低传质阻力是提高柱效主要途径降低传质阻力是提高柱效主要途径。

• 由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效• 液相色谱中，不可能通过液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质恒温增加柱温来改善传质恒温• 改变淋洗液组成、极性是改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素改善分离的最直接的因素 流速大于流速大于0.5 cm/s时时, H～～u曲线是一段斜率不大的直线曲线是一段斜率不大的直线降低流速，柱效提高不是很大降低流速，柱效提高不是很大但在实际操作中，流量仍是一但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数要可选择参数 气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样但在高效液相色谱中，分离柱选用原则与气相色谱一样但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备二、分离类型选择二、分离类型选择 choice of separation types三、三、 HPLC的的应用应用 application of HPLC 1. 1. 环境中有机氯农药残留量分析环境中有机氯农药残留量分析 固定相固定相：：薄壳型硅胶薄壳型硅胶(37 ～～50 m) 流动相：正己烷流动相：正己烷 流流 速：速：1.5 mL/min 色谱柱：色谱柱：50cm 2.5mm(内径内径) 检测器：差示折光检测器检测器：差示折光检测器 可对水果、蔬菜中的农药可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。

残留量进行分析2. 2. 稠环芳烃的分析稠环芳烃的分析 固定相固定相：：十八烷基硅烷化键合相十八烷基硅烷化键合相 流动相：流动相：20%甲醇甲醇-水水 ～～100%甲醇甲醇 线性梯度淋洗，线性梯度淋洗，2%/min 流流 速：速：1mL/min 柱柱 温：温：50 ºC 柱柱 压：压：70  104 Pa 检测器：紫外检测器检测器：紫外检测器四、制备型液相色谱四、制备型液相色谱 preparative liquid chromatography 获得高纯物质（色谱纯）的有效方法获得高纯物质（色谱纯）的有效方法 半制备柱（内径半制备柱（内径8mm，，长度长度15 ～～ 30cm），），一次制备量一次制备量００.1～１～１mg；；1.1.色谱柱的柱容量（柱负荷）色谱柱的柱容量（柱负荷） 对分析柱：对分析柱：不影响柱效时的最大进样量；不影响柱效时的最大进样量； 对制备柱：对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量；不影响收集物纯度时的最大进样量； 超载：超载：进样量超过柱容量柱效迅速下降，峰变宽。

进样量超过柱容量柱效迅速下降，峰变宽 超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k降降低低10%为宜2. 2. 液相制备色谱的方法液相制备色谱的方法收集组分时，通常有以下情况：收集组分时，通常有以下情况： （（1）可获得良好分离，主峰）可获得良好分离，主峰 使用制备柱，超载提高效率；使用制备柱，超载提高效率； （（2）两主成分之间的小组分；）两主成分之间的小组分； 超载，分离切分使待分离组分成超载，分离切分使待分离组分成为主成分（富集）后，再次分离为主成分（富集）后，再次分离制备 3. 3. 制备型液相色谱制备型液相色谱 制备型液相色谱制备型液相色谱：结构与分析型一样，但泵流量大、进结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器 制备柱制备柱：内径内径20～～50mm，，柱长柱长50cm。