我国弓形虫病核酸疫苗研究概况.doc

1我国弓形虫病核酸疫苗研究概况关键词：弓形虫病 StatusintheresearchofnucleicacidvaccineagainsttoxoplasmainChina. 刚地弓形虫（简称弓形虫）呈世界性分布，哺乳动物及鸟类普遍易感人类对弓形虫有较强的自然免疫力，感染后绝大多数无明显症状表现，或只出现亚急性弓形虫病但在孕妇及免疫功能低下者（如 ADIS 病、器官或组织移植后接受免疫抑制剂治疗的病人等）感染弓形虫后引起的危害严重人体弓形虫感染日益受到关注，弓形虫病疫苗成为当前研究的热点动物实验发现，弓形虫全虫疫苗，弓形虫特异抗原组分疫苗有预防弓形虫感染或降低感染度作用，但前者可能会引起再感染，后者的免疫保护效果较差弓形虫病核酸疫苗克服了上述疫苗存在的不足，具有良好的开发应用前景我国从上世纪 90 年代后期开始了弓形虫病核酸疫苗的研制，通过对表达保护性抗原蛋白基因进行重组，先后研制出弓形虫基因单价疫苗、复合疫苗和混合疫苗动物实验证明部分疫苗具有良好的免疫预防效果 1 保护性抗原及目的基因研究 弓形虫裂殖了表面膜蛋白（SAG）［1，2］，致密颗粒蛋白（GRA）［3］和棒状体蛋白（ROP）［4］是重要的弓形虫抗原，这些抗原物质与弓形虫的侵袭性有关，且能诱导宿主的免疫反应。

1.1SAGSAG 是弓形虫裂殖子表面膜蛋白通过对 SAG 的分子结构、生物学和免疫学特性研究发现，有 5 种（分别命名为 P22、P23、P30、P35 利 P43）与弓形虫病免疫有关 21.1.1P30（SAGl）P30 分子质量 30～35kDa 含量约占虫体总蛋白的 3%～5%，主要存在于弓形虫表膜及内膜系统，也可分泌到虫体外环境P30 是重要的弓形虫表面膜蛋白，与虫体的吸附和入侵有关，能被弓形虫急性感染期及恢复期血清抗体识别动物实验证明，用纯化的 P30 蛋白免疫小鼠可显著提高小鼠抗弓形虫感染能力［5］为提高免疫效果，于瑾等［6］构建了含有霍乱毒素 A2/B 亚基基因和P30 基因的重组表达质粒，转化宿主菌 BL2l 后经 IPTG 诱导产生 30-CTA2/B 融合蛋白游东生等［7］将 P30 重组表达质粒转化入 DH5α，Westernblot 证明 IPTG诱导表达的 P30 抗原分子能被抗弓形虫血清识别 1.1.2P22（SAG2）SAG2 是一个基因家族，包括 SAG2B、SAG2C 和 SAG2D其中 SAG2B 表达于速殖子表面，而 SAG2C 和 SAG2D 仅表达于缓殖子的表面。

研究证明，P22 蛋白参与弓形虫的入侵过程，并且与弓形虫速殖子向缓殖子的转化有关P22 的抗原性较弱，但仍能提高免疫动物的免疫水平姚永伟等［8］用 PCR法从 RH 株弓形虫基因组 DNA 中扩增 P22 基因编码序列，克隆入载体 pET-32a，转化大肠埃希菌 BL2l，IPTG 诱导的表达产物能被兔抗弓形虫血清识别龙彩虹等［9，10］构建的 P22 重组质粒转化宿主菌的 IPTG 诱导表达产物也被证明具有良好的抗原性 1.1.3P35 研究发现，P35 蛋白的 C 端区（201～225 及 301～340 号氨基酸）具有高亲水性，利用蛋白质分析软件分析 P35 基因编码的氨基酸序列，发现其编码的氨基酸序列含有多个 T、B 淋巴细胞表位，证明 P35 蛋白具有抗原性林敏等［11］采用 RT-PCR 技术从弓形虫 cDNA 文库中扩增出编码 P35 抗原的基因片段，构建了弓形虫 RH 株表面抗原 P35 基因重组表达质粒 P35/pGEX-21，并在大肠杆菌JMl09 中成功表达了分子质量为 70kDa 融合蛋白，该蛋白能为谷胱甘肽 S 转移酶（GST）单克隆抗体及弓形虫感染的兔血清所识别。

31.1.4P23 与其它弓形虫表面腆蛋白不同，P23 不是 GPI 锚定蛋白，P23 的 N 端连接有糖基化位点，是慢性弓形虫病的一个分子标志疫苗研究发现，24kDa 的多肽物质能诱导产生一定的免疫保护力用 24kDa 多肽免疫动物后，在该动物血液中检测到了抗 P23 抗体［12］闪此认为 P23 可能包含该多肽的免疫表位，其基因序列可能存在同源性是有希望的弓形虫病疫苗候选基冈 1.2GRA 弓形虫致密颗粒秆放多种蛋白（GRA），已经报道的有 8 种，其中研究较多的有 GRAl、GRA4、GRA6 手 GRA8 1.2.1GRAlGRAl 是慢性弓形虫病的标志性抗原分子研究表明，GRAl 可诱导免疫动物产生以 IFN-R 升高为特征的保护性细胞免疫应答彭碧云等［13］将构建的 GRAl 基因重组质粒用脂质体介导，转染到小鼠巨噬细胞 RAW264.7，光学显微镜观察形态学改变并绘制生长曲线结果证明重组质粒的表达产物使巨噬细胞增殖能力增强贾雪梅等［14］利用 PCR 技术从弓形虫 RH 株基因组 DNA 中扩增出 GRAl 基因片段，成功构建了 pEGFP-N3-GRAl 真核表达重组质粒。

1.2.2GRA4GRA4 蛋白分子质量为 40kDa，存在于弓形虫的致密颗粒及纳虫泡中，当速殖子分裂并侵入细胞时 GRA4 被分泌到细胞外，刺激机体免疫系统产生粘膜免疫及全身免疫林绮萍等［15］根据 GRA4 基因序列，设计并合成 PCR 引物，扩增弓形虫 GRA4 基因片段，成功构建了原核表达重组质粒 pGEX-4T-GRA4，该重组子在大肠杆菌中经 IPTG 诱导，表达分子质量为 60.3kDa 的融合蛋白，该蛋白能与免抗弓形虫血清发生反应 1.2.3GRA6GRA6 分子存在于弓形虫的致密颗粒及纳虫泡，与裂殖子的入侵有4关朱翔等［16］采用聚合酶链反应从弓形虫昆山分离株和 RH 株总 DNA 中分别扩增到编码 GRA6 的基因，导入表达载体 PGEX-5X-3，然后在大肠杆菌 BL21-CodonPlus（DE3）-RP 中进行表达经 SDS-PAGE 鉴定表达产物分子质量为49kDa，能被感染弓形虫者特异性 IgM 和 IgG 血清所识别 1.2.4GRA7GRA7 为分子质量 29kDa 的致密颗粒蛋白，在弓形止速殖子、包囊及肠内期虫体均有分布PCR 分析表明，不同地理株弓形虫 GRA7 基因均具有保守性［17］。

重组表达质粒 pGEX-4T—I/GRA7 转入大肠埃希菌 BL21 后经 IPTG 诱导，表达的 GST 融合蛋白具有 GRA7 的抗原性［18］ 1.2.5GRA8 一般认为，GRA8 分子为弓形虫致密颗粒分泌蛋白但 Beghetto 等［19］报道 GRA8 可能是 P35为研究 GRA8 的抗原性和制备高效的弓形虫核酸疫苗，袁仕善等［20］参照 GRA8 序列设计引物，采用 PCR 从弓形虫 RH 株基因组DNA 中扩增出编码 GRA8 的基因片段，分别亚克隆到原核表达质粒 pGEX-4T-2和真核表达载体 pVAXl 上，经 SDS-PAGE 和免疫印迹分析结果表明致密颗粒抗原 GRAS 的原核表达质粒在大肠杆菌中表达了 GRA8 的融合蛋白，分子质量为41kDa:用提纯的真核重组表达质粒免疫小鼠（后腿肌肉注射，每周 1 次，每次50μg，连续 2 周），4 周后检测证实免疫鼠产生了抗弓形虫抗原的抗体，ELSA 滴度 1:100杨慧龄等［21］构建的 pcDNA3.1（+）-GRA8 重组质粒经 PCR 鉴定利测序分析，与 GENEBANK 相应基因序列完全一致 1.3ROP 弓形虫棒状体可分泌棒状体蛋白（ROP），这些蛋白物质的产生与弓形虫入侵宿主细胞有关。

已报道的棒状体蛋白有 8 种，国内研究较多的为 ROP1 利ROP2 51.3.1ROP1ROP1 蛋白为单拷贝的 ROP1 基因表达产物，该蛋白物质能影响宿主细胞的通透性杨秋林等［22］根据 ROP1 基因的碱基序列没计引物，从已构建的 cDNA 文库中筛选出了编码 ROP1 基因的 cDNA 片段，得到分子质量为 70kDa的 GST-ROP1 重组蛋白，经鉴定该融合蛋白大小与预测值相符 1.3.2ROP2ROP2 是一种保守蛋白，含有能被多个免疫个体所识别的 T 细胞表位，在弓形虫速殖子期、缓殖子期及包囊期表达的 ROP2 分广均能诱导宿主产生对弓形虫感染的免疫应答，主要表现为 T 细胞的增生和 IFN-R 的产生，是重要的疫苗候选因子吴乩等［23］根据 ROP2 基因已知序列，设计合成一对 PCR 引物，从弓形虫 RH 株基因组 DNA 中扩增出 ROP2 基因片段，再克隆到 pGEX-4T-1 质粒并在大肠杆菌 BL21（DE3）中进行 ITPG 诱导表达经 SDS-PAGE 分析，ROP2基因 PCR 产物大小与预期相符约 1043bp，测序结果与已知序列基本吻合:免疫印迹显示表达产物具抗原性。

2 弓形虫病核酸疫苗研究 2.1 单基因疫苗 2.1.1P30 基因疫苗占国清等［24］用大量制备的重组真核表层质粒 pBK-P30，经生理盐水稀释至 1μg/μl，1 次肌注免疫 BALB/c 小鼠，通过测定免疫鼠脾脏 T 淋巴细胞转化率及 CD4+、CD8+T 细胞亚群变化观察弓形虫表面抗原 P30DNA 疫苗诱导小鼠产生的细胞免疫应答结果免疫组小鼠 CD8+细胞数量升高，CD4+/CD8+比率下降表明弓形虫表面抗原 P30DNA 疫苗能诱导 BALB/c 小鼠产生细胞免疫应答龚娅等［25］利用 PCR 技术和亚克隆技术分别构建了弓形虫表膜型 P30 基因重组质粒（个完整的 P30 编码序列，包括信号肽）pcDNA3-P30In，并将以上 3 种重组质粒分别与脂质体混合后免疫小鼠，之后的免疫检测证明 3 种表6达形式的重组质粒均能诱导小鼠产生特异性的 IgG 抗体，虽然膜型及分泌型免疫鼠特异 IgG 抗体出现的时间早于细胞内型免疫鼠，但 4 周后的抗体水平 3 组间差异无显著性 2.1.2P22 基因疫苗 P22 分子的抗原性引起了研究者的重视，P22 基因已成为弓形虫疫苗研究的热点。

高世同等［26，27］用构建的 pVAXl-SAG2 真核表达质粒接种小鼠后，用 RT-PCR 方法从注射部位肌肉组织总 RNA 中扩增出 SAG2 目的基因条带;免疫小鼠血 CD4+细胞数升高，并检测到血清抗弓形虫特异性 IgG 抗体证明构建的 SAG2 真核表达重组质粒 pVAXl-SAG2 能在小鼠肌肉中转录表达P22 蛋白，可诱导产生细胞免疫与体液免疫应答龙彩宏等［28］将构建的真核表达重组质粒 pVAXl-SAG2 在质脂体介导下转染 Vero 细胞，Westenblot 分析细胞裂解液样品有 1 条约 17kDa 大小的条带可被弓形虫免疫血清所识别而高世桐等［29］构建的 Pbk-P22 基因重组表达质粒转化宿主菌后的诱导表达产物分子质量为 28kDa，能被弓形虫感染猪血清抗体识别由于所选择的质粒 pBK-CMV 既是原核表达质粒又是真核细胞表达载体，含有 CMV 真核表达启动子，因此认为所构建的 pBK-P22 表达质粒可能是一种理想的弓形虫 DNA 疫苗 2.2 复合基因苗 2.2.1P30-P22 复合基因疫苗单价疫苗显示了一定的免疫效果，但仍不能满足设计要求为增强核酸疫苗的免疫效果，李瑛等［30］将弓形虫表面抗原 P22、P30 的有效基因片段同构建在同一克隆载体 pUCl9 和表达载体 pGEMEXTM-1 上，并保证其连接方向及开放读码框的正确。

古饮民等［31］用 IPTG 诱导含有 P22、P30 复合基因的重组菌表达融合蛋白，并进行了免疫活性检测结果在 66.5kDa 位置的融合蛋白带可与 P30 抗体特异结合，表明质粒重组体表达的融合蛋白与 P30 的抗7原性相同孙怡等［32］将构建的 PCDNA3.1-P30-P22 质粒通过肌内注射直接免疫小鼠，观察其诱导的体液免疫应答及保护性作用结果免疫组小鼠血清抗体水平显著升高，攻击感染后小鼠存活时间显。