【精品】RACE技术和cDNA技术.doc

RACE简介RACE (rapid-amplification ofcDNA ends)是通过 PCR 进行 cDNA 末端 快速克隆的技术cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关 重耍完整的cDNA序列可以通过文库的筛选和末端克隆技术获得发展简史近年来随着生物技术的不断发展，岀现了许多新基因的方法和手段， 如图谱技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术二减法技术以及cDNA文 库筛选技术等但上述方法人多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量 大等特点cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5和3末端 的有效方法，以具简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视经典的RACE技术是由Frohmem等(1988)发明的一项技术，主要通过 RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5,和3’端,包括单 边PCR和锚定PCR该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术 步骤多、时间长、特异性差的缺点(Frohman 1995:Schaefer, 1995: Chen, 1998: Bespalova 等，1998: Mdlz 等 11999)。

对传统 RACE 技术的改进 主耍是引物设计及RT-PCR技术的改进：改进Z—是利用锁定引物((lock docking primer)合成第•链cDNA,即在oligo (dT)引物的3端引入两个简 并的核昔酸【5,-01igo(dT)16_30MN-3, , M二A/G/C;N二A/G/C/T】,使引物定 位在poly (A)尾的起始点，从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT) 与poly(A)尾的任何部位的结合所带来的影响；改进Z二是在"链5 端加 尾吋，采用poly (C),而不是poly (A);改进Z三是采用RNase H •莫洛尼 氏鼠白血.病毒(MMLV)反转录酶或选择嗜热DNA聚合酗可能在高温h (60度 -70度)有效地逆转录mRNA,从而消除了 5 端由丁•高GC含量导致的mRM二 级结构对逆转录的影响；改进ZI丿q是采用热启动PCR (hot start PCR)技术 和降落PCR(touch down PCR)提高PCR反应的特异性随着RACE技术日益完善，冃前已有商业化的RACE技术产品和试剂盒 推出，如CL0NTECH的MarathoTM技术和SMART TM RACE技术。

邢桂春等(2001) 先后使用上述两种盒进行RACE反应，结果发现使用Md“ilh()ri TM所得到的 片断总是比采用SMARTsup]TMRACE盒到所得到的片断短其原因在于 Marathon TM技术反转录反应往往不能真正达到mRW\的5’末端所以认 为,进行RACE反应应当优选SMARTTM RACE盒以下就国内冃前应用最广 的SMART TM RACE盒为例，简要概述RACE技术的原理和操作过程SMARTTM 3 -RACE的原理是：利用mRNA的3 末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合 位点，以连有SMART寡核昔酸序列通用接头引物的0ligo(dT)30MN作为锁 定引物反转录合成标准第一链cDNAo然后用一个基因特异引物GSPKgene specific primer, GSP)作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引 物U PM (universal primer, UPM)作为卜游引物，以cDNA第一链为模板，进 行PCR循环，把冃的基因3 末端的DNA片段扩增出來RACE的优点与筛库法相比较，有许多方面的优点1) 此方法是通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短 的吋间内获得有利用价值的信息。

2) 节约了实验所花费的经费和时间3) 只要引物设计正确，在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基 因的全长实验室现有的RACE试剂盒的简介RACE是一种从一个相同的cDNA模板进行5 和3 末端快速克隆的 方法此方法会产生较少的错误条带此过程中使用的酶混合物非常适合 长链PCRO使用此方法的要求是必须知道至少23-28个核甘酸序列信息，以此 来设计5，末端和3 末端RACE反应的基因特异性引物(GSPs)RACE引物的设计：基因特异性引物(GSPs)应该是：23 —28nt50 — 70%GCTm值265度，Tm值N70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5 和3 RACE反应的基因特异性 引物(GSP1和GSP2).由于两个引物的存在,PCR的产物是特异性的反应中涉及到的一些事项cDNA的合成起始于polyA+RNAo如果使用其它的基因组DNA或总RNA, 背景会很高RACE PCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物 有不同的退火和延伸温度在进行5 和:T RACE PCR的吋候应该使用热启动表4中给出了所有引物的相互关系重叠引物的设计会对全长的产 生有帮助。

另外，重叠的引物可以为PCR反应提供一个对照并不是绝对 的要利用设计的引物产生重叠片段引物GSP中的GC含量耍在50-70%Z间这样可以使用降落PCRo 避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折和形成分子内氢键另 外，避免使用与API互补的引物，尤其是在3 末端如果耍用重叠片段来检测设计的引物，GSpl和GSp2 Z间至少是100 — 200碱基只有这样才可以用扩增的产物來鉴定设计的引物是否正确降落PCR可以明显的增加RACE PCR产物的特异性在最开始的循环 中，退火温度高于API引物的Tm值，可以增加对特异性条带的扩增随后 的退火和延伸的温度降回到API的温度，可以进行随后的PCR循环验证基因特异性引物的对照：单个引物的阴性对照：只用一个引物GSP来进行阴性对照这样不 应该产生任何的条带如果可以看到明显的产物，应该改变循环的参数， 或重新设计原始引物利用两个GSPS进行阳性对照：（只有两个GSP可以产生重叠的时候 才可以采用此步为了确定RNA样品中冃的基因确实表达，利用两个GSP 和接头连接的cDNA来产生阳性对照可以产生两个引物Z间的重叠大小的 片段如果没有这个片段，应该重复cDNA的合成，或者从一个不同的组织 或细胞来源进行cDNA的合成。

制备和抽提polyA+RNA不要使用DEPC处理过的水纯化完mRNAZ后，利用琼脂糖凝胶电泳检测mRNA的质量哺乳动物 的mRNA样品是0. 5-12kb的拖带，在其中有4. 5和1. 9kb的rRNA的条带 非哺乳动物的mRNA应略小具体的实验步月cDNA第一条链的合成：我们建议进行cDNA合成的对照反应，这样可以对样品的cDNA的合 成进行鉴定加入各种试剂Z后，在气浴中42度保温一个小时注意：在水浴或酒精浴中保温回减少反应体积，从而降低第一链的合 成效率将管放于冰上，以终止第一链的合成反应直接进行第二链的合成cDNA第二链的合成:第二链合成的酶混合物中，含有聚合酶、RNasell和连接酶T4 DNA聚 合酶的功能是补平dscDNA的末端我们建议做阳性对照，试剂盒中提供人 类骨骼肌的mRNAo建议进行阳性对照，cDNA的质量取决于制备的polyA+RNA的质量非 哺乳动物样品的niR"A大约在0. 5-3kb Z间通过电泳检测cDNA的产量，与对照进行对比，这样可以有利于在以 后的步骤中对cDNA进行稀習接头的连接及连接产物的稀释按照程序进行连接反应如果没有对比样品和对照的产量,利用Tricine-EDTA buffer制备 接头连接的dscDNA的1/50和1/250的稀習物，用两种稀释物进行以下的 RACE PCR反应，直到鉴定出哪一种稀释可以得到好的效果。

RACE RACE —— PCRPCR扩增扩增•进行5’和3的RACE-PCR扩增•利用以下的程序进行降落PCR反应：94度30秒5个循环：94度5秒72度4分5个循环：94度5秒70度4分钟20-25个循环：94度5秒68度4分钟注意：我们建议使用降落PCR反应，这就要求GSP的Tm值270度当循环结束时，利用1・2%琼脂糖凝胶电泳分析每一个管中的产物5u 1, 使用适当的分子量markero•可以根拥你的基因的特异性来设计最理想的循环参数如果看不到带 或者只有微弱的带，在68度多加5个循环最佳的延伸时间取决于扩增条 带的长度如果片断的长度在2-5kb的时候，经常使用4min, 0. 2~2kb的 时候将延伸时间减到2-3min,对T 5-10kb的条带，延伸时间增加到 10minoRACE产物的验证：应该对RACE的片段进行验证，以此来确定是否已经扩增了理想的产 物如果得到的是多条带或者研究的是多基因家族的成员，验证是非常有 用的有3种验证RACE产物的方法:(1) 比较由GSP和NGSP获得RACE产物2) Southern blot(3) 克隆并测序我们建议最好测得RACE产物的部分序列。

有的时候需要嵌套引物的 存在比较由GSP和NGSP获得RACE产物对丁-5 末端的RACE产物，比较由API和GSP1扩増岀來的产物和由 API和NGSP1扩增出來的产物对丁-3 末端的RACE产物，比较由API和GSP2扩增岀來的产物和由 API和NGSP2扩增岀来的产物这对丁•鉴定多条带是否是上一个PCR的特异 性产物是非常有用的如果条带是正确的，在嵌套PCR反应中的条带应该是略微小一些 基本PCR和嵌套PCR产物的迁移率的不同取决于c D N A结构中GSP1和嵌 套引物的位置RACE产物的克隆和测序：可以利用胶回收试剂盒来回收RACE产物，此试剂盒适合回收2. 5kb 以下的RACE产物；对于长的片段，可以通过电洗脱获得好的结果如果你 选择使用其他的纯化方法，最后用Tricine —EDTA buffer 30 u 1重新悬浮 DNA样品电泳5卩1回收的样品来鉴定回收的质量将回收的PCR产物直接克隆到/A型的PCR克隆载体中另外还可以 利用接头和/或eDMA合成引物中的Notl、Srfl. Xmal. EC0R1等酶切位点， 将产物克隆到常规载体中对于5 端的RACE产物，我们建议挑取至少8-10个不同的克隆以获 得5 端的最大可能性的序列。

反转录并不总是进行到mRNA模板的5 末端，尤其是长模板另外，T4 DNA聚合酶会移走5 末端的0 — 20个碱 基)一旦鉴定了含有插入片断的克隆，应该获得多的序列信息理想的 是，可以对整个开放读码框进行测序包括5 和3 的非翻译区全长cDNA的获得通过部分或全部测序鉴定了 RACE产物后，可以通过两种选择获得全 长的cDNAo通过PCR的方法通过克隆的方法通过PCR的方法获得全长cDNA：扩增长的cDNA需要较长的延伸时间，但是如果延伸的时间过长，可 以产生拖带，所以要慎重的设计引物根据从5 和3 RACE产物获得序列信息设计5和3 GSP引物 这些引物应该來自cDNA的3’或者5 的末端，应该是23 — 28毗长不应 该在引物的末端加上限制性位点，这样会导致高背景在某些时候可以设 计3和5 的嵌套引物但是还是应该先利用一对引物进行PCR反应通过PCR的方法获得全长cDNA：进行如下的热循环：94度30秒25个循环94度5秒72度2-15分钟延。