烟草叶蛋白提取技术研究进展.docx

烟草叶蛋白提取技术研究进展 李猛政 李荣华 夏岩石 郭培国摘要：烟草除了可以作为卷烟原料外，其叶蛋白也是世界上最丰富的蛋白质资源之一烟叶中的蛋白质分为可溶性蛋白质和不溶性蛋白质，其中约一半的可溶性蛋白是FI蛋白（Fraction I protein），另一半是FII蛋白（Fraction II protein）随着科学的发展，许多新技术已应用于蛋白质分离，如双水相萃取法、超滤法、层析法、电泳法等本文根据国内外相关研究资料，对目前分离烟草叶蛋白常用的几种提取技术及进展进行了综述和讨论，并展望了其应用前景关键词：烟草;叶蛋白;提取技术;研究进展Abstract： Tobacco is the raw material of cigarettes in general， but its leaf is one of the most abundant protein resources in the world. The proteins in tobacco leaves can be divided into water-soluble and water-insoluble proteins. Half of the soluble proteins are FI proteins （Fraction I proteins）， and the other half are FII proteins （Fraction II proteins）. With the development of technology， many new technologies have been applied to protein separation， such as aqueous two-phase extraction， ultrafiltration， chromatography， and electrophoresis. According to the relevant research literatures at home and abroad， several commonly used extraction techniques and the latest progress for separating tobacco leaf proteins were reviewed and discussed in this article， and their application prospects were described.Keywords： tobacco; leaf protein; extraction technology; research progress我国是烟草最主要的生产国和消费国之一，每年烟草的种植面积可达100万hm2，生产烟叶约175万t[1]。

蛋白质是烟草众多生物活性成分中含量最为丰富的一种，其在白肋烟中的含量高达20.48%[2]随着对蛋白质研究的不断深入，人们逐渐认识到植物叶蛋白，尤其是烟草叶片中的蛋白质[3]，是世界天然产物中最重要且丰富的蛋白质资源从营养、医疗和食品角度来评价，烟草叶蛋白属于优质蛋白[4]烟草叶蛋白的氨基酸组成和含量相当丰富、均衡，所含的必需氨基酸与鸡蛋、牛奶相接近，用它可以代替牛奶，可为因乳糖不耐受而不宜饮用牛奶的人提供另一种高营养食品蛋白源[5]烟草叶蛋白中富含硒，以硒蛋氨酸和硒半胱氨酸或其他形式存在[6]，在清除自由基、防护红细胞溶血、化学性肝损伤保护等方面都优于不含硒的蛋白质[7]烟草叶蛋白经酶水解提取出的活性十三肽，具有抗菌活性和蛋白酶抑制活性[8-9]，且穩定性较高，是制备抗菌肽和降压肽的重要潜在资源另外，烟草作为最重要的植物生物反应器[10-12]，其叶片生物量大（约100 t/hm2）、叶片可溶性蛋白含量高、有完善的真核表达系统，可以为多种外源蛋白提供正确的翻译后修饰（PTM），表达具有生物活性的外源重组蛋白，可以应用于人或动物的疾病治疗及预防在烟草的种植和加工过程中会有大量的低次烟叶产生，这些低次烟叶往往蛋白质含量较高，会导致烟气中有害物质增加，除少量用于生产烟膏和农药外，大部分被抛弃，既浪费了大量宝贵的资源，又污染了环境。

如果可以从低次烟叶中提取蛋白质，那么烟草的利用率和附加值将大大提高本文根据国内外相关研究资料，对目前分离烟草叶蛋白常用的几种提取技术及进展进行了综述和讨论，并展望了其应用前景烟草叶蛋白可分为可溶性蛋白质和不溶性蛋白质，其中约有一半的可溶性蛋白质是叶绿体蛋白质，即FI蛋白（Fraction I protein），其结晶为六角形、十二面体，大小为18 S，在其酶功能相关研究中又称为核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（简称Rubisco）;另一半是其他可溶性蛋白质的复合物，即FII蛋白（Fraction II protein），大小为4～6 S[13]烟草是唯一可以通过结晶大量提取FI蛋白的植物，鲜烟叶可溶性蛋白提取量如表1所示1根据蛋白质溶解度不同进行分离提取1.1酸碱提取法酸碱提取法是提取叶蛋白的传统方法，也是目前应用较为广泛的方法[15]，利用蛋白质等电点沉降和高温变性的特点，通过对pH的调节及温度的控制，使蛋白沉淀[16]，从而得到烟草叶片的粗蛋白赵谋明等[17]以低次烟叶为原料，采用氢氧化钾和磷酸调整pH，在料液比1：17、提取温度60 ℃、pH 8.0的条件下磨浆2次;然后在温度60 ℃，pH 8.0，时间60 min，搅拌条件下碱溶提取3次;最后在pH 3.0，4 ℃下静置8 h，4800 r/min、20 ℃离心30 min，烟叶蛋白提取率最高可达86.71%。

田少君等[18]在单因素试验的基础上，选择pH、加热时间和加盐比例为自变量，以烟叶蛋白的提取率为响应值，研究各自及交互作用下对烟叶蛋白提取率的影响，结果得出pH和加热时间对烟叶蛋白提取率的影响不存在交互作用，pH对烟叶蛋白提取率的影响更为显著卫青等[19]为回收薄片厂抄造段浓白水中的蛋白质，减少造纸法再造烟叶生产中有机物对环境的污染，分析pH对提取烟叶蛋白的影响，结果发现，当碱沉pH一定时，烟叶蛋白在酸溶pH为3.5处沉淀量最大;当酸溶pH一定时，烟叶蛋白在碱沉pH为8.0处沉淀量最大，所以得到最佳提取工艺参数为酸溶pH=3.5，碱沉pH=8.01.2有机溶剂提取法酚提法是一种常用的有机溶剂提取方法，用含有30 %（m/V）蔗糖的苯酚提取液充分溶解烟叶粉末，通过甲醇或丙酮沉淀对酚相中的蛋白进行纯化和浓缩，而多糖、核酸等水溶性物质则留在水相中[20]，具有较高的分辨率韦玉梅等[21]使用含十二烷基硫酸钠（SDS）的缓冲液来增加烟叶蛋白的溶解度，利用酚在SDS这种阴离子型表面活性剂存在的条件下能充分溶解蛋白的特点，可以在较短的时间内充分溶解烟叶蛋白，得到较高纯度的蛋白质，所获双向电泳（2-DE）图谱中蛋白质点多且清晰，背景干净，重复性好。

尤垂淮等[22]以烟草主栽培品种K326为材料，比较了5种不同植物叶蛋白样品制备方法对双向电泳分析结果的影响，结果表明采用苯酚提取烟叶蛋白的方法较可靠，去除了烟草叶片酚类、色素和多糖等干扰蛋白质提取的物质，可以有效减少烟叶蛋白在提取过程中的损失，获得的2-DE图谱中蛋白质点数量最多，最清晰，分离效果好三氯乙酸（TCA）/丙酮沉淀法是植物蛋白样品制备最基本的方法，最初由DAMERVAL等[23]设计，利用蛋白質在酸性和疏水条件下变性的原理进行分离提取，并能有效去除污染物，达到富集蛋白质的效果王绍美等[24]研究了旺长后期和苗期烟草叶蛋白样品的制备方法，分别采用稍加改进的TCA/丙酮法和蛋白质分级提取、酚抽提及丙酮洗涤相结合的方法，建立了适用于不同发育时期烟草叶片蛋白质组研究的双向电泳实验体系旺长后期的烟草叶蛋白样品经过TCA/丙酮提取，预冷丙酮沉淀2次后，选用pH 4～7的17 cm IPG（immobilized pH gradient）预制胶条，上样体积170 μL（总上样量1 mg），可以得到重复性较好，蛋白质点清晰的2-DE图谱;苗期烟草叶蛋白样品通过蛋白质分级提取、酚抽提及丙酮洗涤后，选用pH 4～7的24 cm线性IPG胶条，水化12 h上样，上样体积450 μL（总蛋白量1.5 mg），可以得到背景干净，蛋白质点清晰的2-DE图谱。

1.3双水相萃取法双水相萃取法（ATPE）是一种易于放大、操作条件温和、可连续化操作的新型提取技术双水相萃取与传统的萃取原理相似，都是利用蛋白质在两相间的选择分配差异而进行分离纯化，不同之处在于萃取体系的性质当蛋白质进入双水相体系后，在范德华力、疏水作用、静电作用和界面张力的作用下，选择性地富集到上相或下相，从而实现目标蛋白与杂质的选择性分离[25]BALASUBRAMANIAM等[26]研究了以蛋清溶菌酶（碱性蛋白）为模型蛋白使用ATPE从烟草蛋白中纯化重组蛋白的适用性，通过改变聚乙二醇（PEG）的分子量、PEG浓度、无机盐的种类和浓度、pH等条件来得到烟草蛋白在聚合物-盐双水相体系中的最佳分配系数结果发现PEG/硫酸钠系统最适合蛋清溶菌酶的纯化，当满足pH为7.0、PEG（分子量为3400）质量分数为10%、硫酸钠质量分数为16.2%且氯化钠浓度保持在0.19 mol/L时，可以得到蛋清溶菌酶87%的产率ROSS等[27]研究了使用ATPE分离纯化酸性蛋白的可行性，以烟草转基因酸性重组蛋白β-葡萄糖醛酸苷酶（rGUS）为目标蛋白，通过部分析因设计（fractional factorial designs）的筛选实验，确定了PEG/磷酸钾为纯化rGUS的最佳双水相系统，经过响应面法（RSM）分析，当满足pH为8.0、PEG（分子量为3400）质量分数为13.4%、磷酸钾质量分数为18%且氯化钠浓度保持在0.789 mol/L时，得到的rGUS回收率最大，可达74%。

ATPE用于分离纯化蛋白质是替代昂贵层析法非常有前景的方法，但大规模生产应用还需解决相系统的恢复问题1.4结晶和重结晶法结晶法是某种物质通过降温或蒸发的方法在浸提液中以晶体状析出的过程初次结晶所获得的晶体多含杂质，通过再次结晶可以获得较纯的晶体，这一过程也被称为重结晶[28]郭培国等[14]为了简捷大量地提取烟叶中FI蛋白，经过反复研究和探索，发现新鲜烟叶经亚硫酸钠溶液处理后再加入防褐变剂，可抑制或除去多酚氧化酶活性，大大降低粗提液的褐变程度;又根据FI蛋白多种物理化学特性与其他蛋白的差异，如盐溶性、耐热性、化学试剂反应等，初步将FI蛋白与其他蛋白分离及除去有色物质，在低温等条件下加入少量FI蛋白晶体，保存2～3 d后，有大量白色晶体析出，再经过脱盐处理，可以得到纯净的FI蛋白晶体，最终每千克鲜烟叶可提取FI蛋白5.12 g，FII蛋白6.27 g，总提取率为71.28 %2根据蛋白质分子量不同进行分离提取2.1超滤膜法膜分离技术是以压力为推动力，依靠膜的选择性，将液体中的组分进行分离的方法，包括微滤（MF）、超滤（UF）、纳滤（NF）和反渗透（RO）4种SHI等[29]采用中空纤维UF-NF-RO膜集成工艺从废弃烟叶中提取纯化烟叶蛋白，在连续的超滤和纳滤中，烟叶蛋白的截留率分别达到87.9 %和98.5 %，所产生的废水经中空纤维反渗透膜过滤后，可无害化处理。

魏赫楠等[30]为优化超滤膜提取烟叶蛋白的工艺参数，以蛋白质截留率和渗透通量为综合指标，系统讨论了提取温度、料液pH和操作压强对烟叶蛋白提取率的影响，最终得到提取烟叶蛋白的最佳工艺参数为：提取温度22 ℃、料液pH 5.0、操作压强0.10 MPa，烟叶蛋白的平均截留率可达85.2%膜分离过程没有相变，能够保持天然蛋白质的物理化学特性，但是膜两。