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流感病毒研究进展孙向东作者单位 : 315010 宁波市医学信息研究所通讯作者 : 孙向东 ， 电子信箱 : sxdyy@126． com流感病毒分为甲型 ( 国外称为 A 型 ) 、乙型 ( 国外称为 B 型 ) 和丙型 ( 国外称为 C 型 ) 其中甲型流感病毒于 1933 年由 Smith 等［ 1］人通过雪貂培养分离 ，因其变异及进化速度快 、抗原多变 、感染性和致病性强 、传播速度快而成为造成人类季节性流感和历史上大流感的主要病毒 ， 也是病毒研究者的主要研究对象［ 2， 3］20 世纪至今先后多次暴发全球性大流感 ， 其中以 1918、1957、1968 和 2009 年这 4 次大流感影响最为深远［ 2， 3］1918 年 ， 甲型 H1N1 流感在西班牙暴发并传遍全球 ， 直接或间接 ( 二次感染或诱发机体其他疾病 ) 造成全世界约 2．5%( 近 5000 万 ) 人口死亡 ;1957 年 ， H1N1 流感病毒与禽流感 H2N2 病毒发生重配作用 ， 禽类的 HA、NA、PB1 3 个基因替代了人类H1N1 流感病毒的原有基因 ， 形成新型 H2N2 流感病毒［ 4， 5］; 1968 年 ， H2N2 流感病毒又与禽流感 H3 病毒发生重配作用 ， 禽类的 HA、PB1 两个基因替代了人类H2N2 流感病毒的原有基因 ， 形成新型 H3N2 流感病毒［ 4， 5］; 2009 年 4 月甲型 H1N1 流感从墨西哥和美国暴发 ， 这株 H1N1 流感病毒是由曾散发感染人类的北美H1N2 三联重配体猪流感病毒 ( triple －reasstortant swinevirus) 和主要在欧亚猪中传播的欧亚 H1N1 类禽样猪流感病毒 ( Eurasian avian －like swine virus) 的重组体 ， 欧美研究者一般将其称为猪源甲型 H1N1 流感病毒 ［ swine －origin influenza A ( H1N1 ) virus， S －OIV］［ 4， 5］。

本文对流感病毒的基因组学 、生物信息学 、结构生物学和药物基因组学等多个交叉学科的方法和研究进展予以介绍 ， 帮助理解流感病毒抗原性 、致病性和抗药性等性状的内在机制 为表述方便起见 ， 除个别专业名称外全文均将 “甲型流感病毒 ”简称为 “流感病毒 ”一 、流感病毒基因组的基本特征和受体特异性流感病毒基因组由 8 个线性的负链 RNA 基因组片段组成 ， 全长约 13． 6kb， 分别编码 HA、NA、M1、M2、PA、PB1、PB2、NP、NS1、NS2、PB1 － F2 等 11 个已知的病毒蛋白质 ( 一个基因组片段通过不同阅读框编码 1 到 2 个蛋白质 )［ 2， 3］其中 ， 血凝素 ( hemagglu-tinin， HA) 、神经氨酸酶 ( neuraminidase， NA) 和离子通道蛋白 M2( M2 ion channel) 作为跨膜蛋白位于病毒包膜 ( envelope) 表面 ; 基质蛋白 M1( matrix protein) 和核蛋白 NP( nucleoprotein) 位于包膜内 ， M1 覆盖在包膜内侧形成基质蛋白层 ， NP 包被在病毒 RNA( vR-NA) 表面并与 M1 连接 ; 病毒聚合酶 ( polymerase) 的 3个亚单位 PA、PB1 和 PB2 形成异聚体后与 vRNA 组装成核蛋白复合物 ( ribonucleoprotein complex， RNP) ;非结构蛋白 ( non － structural protein) NS1、PB1 － F2 和NS2， 又称为核输出蛋白 ( nuclear export protein， NEP)分别起到抑制宿主细胞免疫反应和介导 vRNA 输出宿主细胞核的作用 。

根据 HA 和 NA 的抗原性 ， 可以把甲型流感病毒分为 16 种 HA 亚型 ( H1 ～ H16) 和 9种 NA 亚型 ( N1 ～ N9) ， 其中 H1N1、H3N2 等为较常见的季节性流感病毒 ， 禽流感 H5N1 则为高致病性流感病毒 人流感病毒 、禽流感病毒 ( avian virus， AIV) 和猪流感病毒 ( swine influenza virus， SIV) 的核心区别在于病毒 HA 与宿主细胞结合的特异性［ 2， 3］人流感病毒与唾液酸 α2， 6 半乳糖苷 ( sialic acid α2， 6 － galac-tose， SAα2， 6 － Gal) 特异性结合 ， SAα2， 6 － Gal 主要分布在人鼻咽 、气管和支气管等部位的上皮细胞 ; 而禽流感病毒则与分布在禽类肠道上皮细胞上的唾液酸 α2， 3 半乳糖苷 ( sialic acid α2， 3 － galactose， SAα2，3 － Gal) 特异性结合 正是由于人类和禽类流感病毒具有不同的唾液酸受体 ， 使得禽流感病毒不太容易直接感染人类及在人类传播 与人类和禽类流感病毒所不同的是 ， 猪流感病毒同时具备 SAα2， 6 － Gal 和SAα2， 3 － Gal 的结合能力 ， 因此猪能够同时感染包括猪流感 、禽流感和人流感等多种流感病毒 ， 成为病毒基因组发生重配作用 ( reassortment) 的主要中间宿主 ， 也是人类感染禽流感病毒的主要来源［ 2， 3］。

二 、流感病毒的生物信息学研究生物信息学为流感病毒的研究提供了资源丰富·52·医学研究杂志 2011 年 12 月 第 40 卷 第 12 期·医学前沿 ·的数据库和分析工具 WHO 于 1952 年建立了全球流感监测网络 ( WHO global influenza surveillance net-work， GISN) 统一协调 、收集和管理全球的流感毒株和监测信息 目前 GISN 由来自全球 104 个国家的134 个国家流感中心 ( national influenza centre， NIC)和 5 个 WHO 流感参比和研究合作中心 ( WHO collab-orating centre， WHOCC) 组成 研究人员和公众均可按照一定权限从 GISN 的系统 FluNet 查询全球流感监测数据 、疫情分析 、WHO 推荐流感疫苗株等信息 NCBI 的流感病毒资源中心 FLAN 不仅作为全球最大的公共流感病毒基因组序列数据库 ， 还提供了 blast、聚类 、构建系统发生树等工具 美国 NIAID建立的流感研究数据库 IRD 收集了流感病毒基因组序列 motif( 保守序列 ) 、蛋白质功能注释 、单核苷酸多态性 ( single nucleotide polymorphism， SNP) 和三级结构等多种病毒信息 ， 也提供了序列特征分析等生物信息学工具 。

北京基因组研究所也建立了我国流感病毒数据库 IVDB生物信息学还能研究与抗原性相关的基因组生物信息学特征 、基因组位点共进化和网络模块特征 ，预测季节性流感的抗原变化 Huang 等［ 6］和 Gendoo等［ 7］均研究基因组序列 motif 与抗原肽位之间的关联性 ， 帮助利用突变位点预测抗原性的变化 ; Du 等［ 8］和Xia 等［ 9］均从位点共进化角度出发 ， 建立进化关联网络来研究网络模块与抗原性变化的联系 Liao 等［ 10］发展了整合记分和回归的分析方法预测 H3N2 流感病毒的抗原变异位点 Plotkin 等［ 11］利用 HA 序列的分子进化和聚类分析方法预测流感流行株 ， 作为季节性流感疫苗研发的参考 Smith 等［ 12， 13］根据 HA 抑制试验 ( hemagglutination inhibition assay， HI assay) 的结果 ， 使用 k － 均值聚类法 ( k － means clustering algo-rithm) 构建抗原谱 ( antigenic map) 利用二维抗原谱 ， 一方面可以直接用于直观的观察抗原变化趋势 ;另一方面 ， 也可以通过比较分析分子进化与抗原进化的联系与差别 ， 更准确地揭示和预测抗原进化 ， 从而为疫苗准备提供帮助 。

三 、流感病毒的结构生物学和药物基因组学研究结构生物学已经揭示了 HA、NA、M2、NS1、PA、PB1、PB2 和 NP 等流感病毒主要蛋白质的整体或部分结构 ， 有助于理解基因序列功能域的作用机制 ， 观察HA、NA、M2 这些表面蛋白质与受体 、抗体的结合部位 ，了解 RNP 的组装过程和催化特征 ， 通过改变环境条件分析环境因素对蛋白质构象和功能的影响［ 14 ～16， 20， 21］由于蛋白质复合物空间结构的高度复杂性 ， 目前只能通过两两组合来研究局部空间结构［ 19， 20］结构生物学还能帮助理解药物作用机制和病毒对药物抗性的机制 ， 为抗流感药物开发寻找潜在的靶点［ 22］常见的抗流感病毒主要分为两类［ 23］: 离子通道蛋白 M2 抑制剂和 NA 抑制剂 在流感病毒侵入宿主细胞的过程中 ， 需要 H+离子通过 M2 的离子通道进入病毒 ， 将病毒基因组和蛋白质释放入宿主细胞质完成去包被过程 ; M2 抑制剂金刚烷 ( adamantane) 包括金刚烷胺 ( amantadine) 和金刚乙胺 ( rimantadine) ，通过结合在 M2 通道内侧阻断 H+离子内流 ， 从而在病毒复制的早期阶段干扰感毒的去包被过程 ， 影响流感病毒对宿主细胞的侵入 。

M2 上 Ser31Asn 和Leu26Phe 这两个突变位于金刚烷与 M2 通道结合部位附近 ， 影响金刚烷对 H+离子的阻断作用 ， 从而对M2 抑制剂产生抗性［ 22， 23］据估计 1995 ～2005 年间全球分离到的 M2 抑制剂抗性病毒 98% 以上都携带有 Ser31Asn 突变 ， 但抗性病毒株流行的具体原因尚不明确 ， 研究发现抗病毒药物的选择性压力并不是产生抗药性的决定性因素［ 23］NA 在病毒复制晚期通过切割宿主细胞表面的唾液酸释放病毒颗粒 ， 帮助复制后的流感病毒脱离宿主细胞 ， 促进病毒的传播 由于 NA 抑制剂包括奥司他韦 ( oseltamivir， 商品名 : tam-iflu 达菲 ) 和扎纳米韦 ( zanamivir， 商品名 : relenza 依乐韦 ) 的化学结构与唾液酸很相似 ， 因此通过与流感病毒 NA 活性位点特异性结合阻滞 NA 切割唾液酸 ， 造成病毒颗粒不能从宿主细胞表面脱离以及中断病毒从呼吸道黏膜的播散 ， 抑制了病毒的增殖和扩散［ 23］奥司他韦与扎纳米韦结合唾液酸的差别在于奥司他韦的结合需要 Glu276 的构象改变 ， 而 Arg292Lys、Asn294Ser 和 His274Tyr 这 3 个位点突变影响 Glu276改变构象 ， 使奥司他韦无法与 NA 结合起到阻滞作用而产生抗药性 ， 但对扎纳米韦不会产生抗性 ; 其中His274Tyr 在 H1N1 季节性流感中最为常见［ 23， 24］。

还有一些潜在的抗病毒药物 ， 例如 ， HA( HA1 + HA2)以三聚体的形式存在 ; HA1 的头部是唾液酸受体结合区域 ， 也是人类抗体作用的抗原部位 ， 而小分子化合物叔丁基对苯二酚 ( tert － Butylhydroquinone， TB-HQ) 通过与形成融合肽之前的 HA 三聚体结合 ， 抑制HA 在低 pH 条件下发生构象改变 ， 从而阻止病毒与宿主细胞融合的过程［ 25］但 TBHQ 的 HA 结合位点只在 H3 等第 2 类 HA 亚型中存在 ， 而在 H1、H2 和H5 等第 1 类 HA 亚型中则不存在 流感病毒的致病·62··医学前沿 · J Med Res， Dec 2011， Vol．40 No．12性主要考虑病毒与宿主细胞受体的结合能力 、感染。