芳香制品中邻苯二甲酸酯类的分析及其 对人类角质细胞的毒性研究.pdf

．芳香製品中鄰苯二甲酸酯類的分析及其對人類角質細胞的毒性研究．＊通訊作者：詹錦豐＊地址：臺中縣沙鹿鎮中棲路34號＊電話：04-26318652 ext 5314 傳真：04-2632-1046 E-mail:cfchan@sunrise.hk.edu.tw芳香製品中鄰苯二甲酸酯類的分析及其 對人類角質細胞的毒性研究王立敏1 郭俊成2 廖文昌3 張巧筠4 詹錦豐4*1台中榮民總醫院急診部; 國立陽明大學2嘉南藥理科技大學化妝品應用與管理系3長庚技術學院嘉義校區護理系4弘光科技大學化妝品應用系收到日期：98.10.17 修訂日期：98.11.13 接受日期：98.11.24摘要鄰苯二甲酸酯類(phthalates)廣泛的用於食物包裝、醫療及化妝品作為增塑劑、助溶劑或定香劑苯二甲酸酯類屬於一種環境荷爾蒙，許多的報導指出其可能造成雄性老鼠生殖系統的毒性或產生肝毒性，但對於皮膚系統之傷害則較少著墨，本研究的目的即在研究市售之芳香製品包括香水、室內芳香劑及精油等產品中鄰苯二甲酸酯類的種類與含量分析，與對皮膚角質細胞的毒性作用以氣相層析質譜儀(GasChromatographyMass)分析34種芳香製品後發現，在香水、室內芳香劑等20項產品中，11項產品(55%)含鄰苯二甲酸二乙酯(Diethylphthalate,DEP)，其DEP最高的劑量達19,800ppm。

有1項產品(5%)含鄰苯二甲酸二丁酯(Dibutylphthalate,DBP)，其DBP的劑量高達36,085ppm而在分析的14種精油中則並未發現有含有任何的鄰苯二甲酸酯類在測量多種鄰苯二甲酸酯類對人類角質細胞株(HaCaT)的毒性後發現，DEP的IC50為0.54mg/ml我們的研究顯示不管國內或國外的產品，目前在香水中仍含有相當高比例的DEP或DBP，也提醒國人重視化妝品中含有鄰苯二甲酸酯類的安全性問題關鍵詞：鄰苯二甲酸酯類、氣相層析質譜儀、人類角質細胞株70．弘光學報58期．71壹、前言鄰苯二甲酸酯類廣泛的添加於聚氯乙烯(polyvinylchlorides)，作為塑膠製品的增塑劑(Ito,etal.,2007)鄰苯二甲酸酯類存在於我們生活中許多的消費產品中，例如食物包裝、醫療設備(例如血液袋子)，兒童的玩具、木頭、油漆、室內裝飾品等鄰苯二甲酸酯類也存在於化妝品中被用作為芳香物質的溶劑，例如指甲油及香水等(Fromme,etal.,2007;Ito,etal.,2007;Itoh,Yoshida,Ito,etal.,2007;Lovekamp-SwanO'Brien,Twaroski,Cunningham,Glauert,Duty,etal.,2003;Liu,Lehmann,Sar,Young,Huber,Grasl-Kraupp,NCI)及美國環境保護署(EnvironmentalprotectionAgency;EPA)將鄰苯二甲酸酯類例如DEHP分類為潛在致癌物(probableorpossiblecarcinogen)(張碧芬,2000)。

歐盟也於2005年年底新增了鄰苯二甲酸酯類的指令(2005/84/EC)，嚴格限制鄰苯二甲酸酯類製品的成分含量，並於2007年1月16日起付諸實施(“Directive2005/84/ecoftheeuropeanparliament“,2005)，由此可見鄰苯二甲酸酯類研究的重要性而在台灣近年的研究也發現許多因飲食而攝入的鄰苯二甲酸酯類，並在人的尿液樣本中檢測到鄰苯二甲酸酯類其中又以monomethylphthalate(MMP)，monobuthylphthalate(MBP)及MEHP的含量較高(Chen,Chen,Tang,5mgMTT/mlinH2O)在370C處理3小時後，移去培養基並加入200µldimethylsulfoxide(DMSO)，充分混合使結晶溶解後，用enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)reader(TECAN,Austria)，O.D.570nm測定細胞存活率三、統計每一次實驗進行三重複試驗並重複三次，統計的結果以Studentt´stest及ANOVA進行分析，當p<0.05時代表兩樣本族群有顯著的統計差異。

參、結果一、標準品的滯留時間分析六種標準品Diethylphthalate、Dibutylphthalate、Dipentylphthalate、Bis(methylglycol)phthalate、Benzylbutylphthalate及Di-n-octylphthalate的滯留時間分布在9-18分鐘之間(圖一)，以DEP出現的時間最早(9.2min)，依序為DBP(11.9min),DMEP(12.1min),DPP(13.1min),BBP(14.4min),DOP出現的時間最晚(17.2min)二、 香水與精油中中檢測出鄰苯二甲酸酯．弘光學報58期．73類的種類與含量分析以 D E P 為 標 準 品 的 檢 量 線 其 結 果 在1-780ppm間為線性關係，線性迴歸相關係數r2=0.996，Y=-252757+7956.7X，在10ppm以下訊號及雜訊比(signalnoiseratio)在10以下定義為計量限制(limitofquantitation,LOQ)，並定義為未檢出在20種香水(F1-F20)中共檢測出DEP及DBP兩種鄰苯二甲酸酯類(表一)，並無他種的鄰苯二甲酸酯類被檢出，其中有2種香水(F12及F14)其DEP含量過10,000ppm，其含量分別為19800ppm及11900ppm(表一)。

而有一種香水(F3)同時被檢測出含有DEP及DBP，其DBP含量更高達36085ppm(表一，圖三)在20種香水中共有11種香水(F3、F4、F5、F7、F8、F12、F13、F14、F18、F19及F20)被檢測出含有DEP，其比例高達55%，而在DBP部份僅F3被檢出，被檢出比例為5%(表二，圖三)有別於香水，在檢測的14種精油(EO1-EO14)中包含迷迭香、廣霍香、玫瑰花、肉桂皮及香茅等，不管國內外製造都沒有被檢測出含有任何一種鄰苯二甲酸酯類(表二)，顯示在精油的製品其添加鄰苯二甲酸酯類的情形不像香水般普遍三、香水生產國國別的分析分為國外製造及台灣製造二類進行比較，其中國外製造的香水其含DEP的比例為68%(11/16)而本國製的香水(F1、F3、F17、F18)則被檢出DEP的比例為50%(2/4)(表三)；在本國製的中香水中有一例(F3)被檢測出含有DBP(圖三)，顯示不管國內或國外知名品牌的香水都有相當高比例的香水添加鄰苯二甲酸酯類四、 DEP及DBP對皮膚角質細胞毒性的分析以MTT方法分析其DEP與DBP對人類角質細胞(HaCaT)的毒性發現，DEP在0.125mg/ml到1mg/ml間對HaCaT的細胞有劑量反應的作用(doseresponseeffect)(圖四)，DEP在0.25mg/ml就開使有明顯的抑制HaCaT生長的作用，經內插法計算求得其IC50為0.54mg/ml。

而DBP則對HaCaT不管在0.25mg/ml或0.5mg/ml都無明顯的細胞毒性(圖五)肆、討論早 在 1 9 7 6 年 美 國 中 立 性 的 民 間 組 織CosmeticIngredientReview(CIR)的科學家已回顧許多化妝品的原料的安全性包括許多種類的鄰苯二甲酸酯類在化妝品的使用在1985年CIR第一次的回顧報告指出在化妝品中DMP、DBP及DEP的安全劑量分別為5%、25%及50%(CIR,1985)在2003年的第二次回顧更依據鄰苯二甲酸酯類在人體尿液代謝產物的量認為在化妝品中存在的鄰苯二甲酸酯類的量對人類是安全無虞的(CIR,2005)從1998-2000年美國的另一機構NationalToxicologyProgram(NTP)指出已在化妝品中的鄰苯二甲酸酯類的量對於生殖毒性危害幾乎是可忽略的歐盟最新頒布的關於鄰苯二酸鹽的新指導標準（第2005／84／EC），將於2007年1月16日起開始執行該新標準的要求，DEHP（鄰苯二甲酸二己酯）、DBP（鄰苯二甲酸二丁酯）和BBP（鄰苯二甲酸苯基丁酯）相應的DINP（鄰苯二甲酸二異壬酯），DIDP（鄰苯二甲酸二異癸酯）和DNOP（鄰苯二甲酸二辛酯）限制在兒童玩具和服裝及所有可能被放入口中的物品中使用，含量不得超過0.1％(“Directive2005/84/ecoftheeuropeanparliament“,2005)。

另一方面歐盟的ScientificCommitteeonCosmeticsandNon-FoodProducts(SCCNFP)在評估許多化妝品的產品安全性後指．芳香製品中鄰苯二甲酸酯類的分析及其對人類角質細胞的毒性研究．74圖一、六種鄰苯二甲酸酯類的結構式圖二、 六種鄰苯二甲酸酯類標準品GC-MS滯留時間的分析. 六種鄰苯二甲酸酯類標準品GC-MS滯留時間的的先後順序依序為1: DEP, 2: DBP, 3: DMEP, 4: DPP, 5: BBP, 6: DOP圖三、F3香水樣品的GC-MS 分析. F3同時被檢測出含有DEP及DBP兩種鄰苯二甲酸的酯類1：DEP 2：DBP 3：DMEP．弘光學報58期．75圖四、DEP對HaCaT細胞的劑量反應的關係. 隨著DEP的濃度越高對人類角質細胞株HaCaT的毒性越強(n=3) ，顯示DEP對HaCaT細胞的毒性作用有劑量反應的關係圖五、DEP及DBP對HaCaT細胞毒性的作用. DEP在0.5mg/ml的濃度可以顯著的抑制DBP對HaCaT細胞的生長 (p*<0.05, n=3)，0.5mg/ml DBP則無抑制HaCaT細胞的生長的毒性作用．芳香製品中鄰苯二甲酸酯類的分析及其對人類角質細胞的毒性研究．76出DEP在化妝品中的含量對於人體是安全的但DBP則不應蓄意的被添加在化妝品中(SCCNFP,2002)。

美國NTP則指出人體對DBP的暴露途徑以食物為主而非化妝品等暴露途徑(NTP,2000)，然而許多的研究指出在使用成人或嬰兒的衛生保養品後在其血液或尿液中鄰苯二甲酸鹽酯類的代謝產物的含量都比未使用前高很多(Duty,Ackerman,Calafat,Sathyanarayana,etal.,2008)，且鄰苯二甲酸鹽酯類已廣泛被使用在生活用品中舉凡食品、藥品、玩具、醫療器材及化妝品等都有，實在很難完全評估其暴露途徑的安全性(Duty,etal.,2003;HubingerNationalYanMingUniversity2DepartmentofCosmeticScience,ChiaNanUniversityofPharmacyandScience3DepartmentofNursing,ChangGungInstituteofTechnology4DepartmentofAppliedCosmetology,HungkuangUniversityReceived17October2009;accepted24November2009AbstractPhthalatesarepresentinmanydailyconsumerproducts,suchasfoodwrappings、medicaldevicesandcosmeticsassolventsorplasticizers.Phthalatesar。