临床分子遗传诊断之现况与发展.ppt

Advances in Clinical Molecular Genetics 临床分子遗传诊断之现况与发展台大医院台大医院基因医学部基因医学部苏怡宁医师苏怡宁医师Adrenoleukodystrophy is an X-linked disorder which is secondary to a mutation in the ABCD1 gene and results in the apparent defect in peroxisomal beta oxidation and the accumulation of the saturated very long chain fatty acids in all tissues of the body. The manifestations of the disorder occur primarily in the adrenal cortex, the myelin of the central nervous system, and the Leydig cells of the testes.   ABCD1 is an ATPase binding cassette protein in the same category of transporter proteins such as the CFTR and MDR proteins.肾上腺白质退化症 ALDGenetic informationGenetic informationATP-binding cassette, sub-family D (ALD), member 1Gene symbol : ABCD1Location : Xq28基因遗传疾病基因遗传疾病 (Genetic (Genetic disorders)disorders)•细胞遗传诊断细胞遗传诊断细胞遗传诊断细胞遗传诊断 (Cytogenetic approach)(Cytogenetic approach)(Cytogenetic approach)(Cytogenetic approach)•染色体异常染色体异常染色体异常染色体异常 (Chromosome Abnormalities) (Chromosome Abnormalities) (Chromosome Abnormalities) (Chromosome Abnormalities) •分子遗传诊断分子遗传诊断分子遗传诊断分子遗传诊断 (Molecular genetic approach)(Molecular genetic approach)(Molecular genetic approach)(Molecular genetic approach)•单一基因疾病单一基因疾病单一基因疾病单一基因疾病 (Single-Gene Disorders) (Single-Gene Disorders) (Single-Gene Disorders) (Single-Gene Disorders) •多基因疾病多基因疾病多基因疾病多基因疾病 ( ( ( (MultifactorialMultifactorialMultifactorialMultifactorial Disorders) Disorders) Disorders) Disorders) •粒线体疾病粒线体疾病粒线体疾病粒线体疾病 (Mitochondrial Disorders) (Mitochondrial Disorders) (Mitochondrial Disorders) (Mitochondrial Disorders) Cytogenetic-Related TechniquesMolecular Genetic-Related TechniquesCGHFISHSNP AnalysisGene Dose AnalysisPRINsLength Mutation AnalysisSTR AnalysisKaryotyping遗传基因诊断遗传基因诊断遗传基因诊断遗传基因诊断(+)(+)(+)(+)遗传疾病遗传疾病遗传疾病遗传疾病??????疾病患者照護疾病患者照護疾病患者照護疾病患者照護產產前胎兒診斷前胎兒診斷前胎兒診斷前胎兒診斷遺傳基因遺傳基因診斷診斷 (-)遺傳諮詢遺傳諮詢遺傳諮詢遺傳諮詢白化症白化症Single Gene Diseases•Over 3000 known human monogenic disorders•Over 600 genes involved have been mapped遗传方式遗传方式•自体显性遗传自体显性遗传( (AD,AutosomalAD,Autosomal dominant) dominant)•自体隐性遗传自体隐性遗传( (AR,AutosomalAR,Autosomal recessive) recessive)•性联遗传性联遗传(X-link dominant/ X-link (X-link dominant/ X-link recessive)recessive)ADADDe Novo De Novo InheritedInherited结节性硬化症(TSC)•结节性硬化症(TSC)是一种自体显性遗传疾病，估计其盛行率约为1/10000。

•目前研究了解，已知有两个基因之突变与结节性硬化症有关，分别是TSC1及TSC2•依过去之文献报告，有关TSC1及TSC2之突变皆多属于单点突变，且不同之患者突变点点位皆不相同，约60～70％之患者属于新发生之突变，而与过去确认之突变点皆不相同，对突变分析而言，相当因难进行大规模之分析， 神经纤维瘤简介神经纤维瘤简介•神经纤维瘤是一种遗传性的神经外胚层生成疾病，•依照所侵犯的范围分为第一型(周边型)和第二型(中枢型)•神经纤维瘤第一型(简称NF-1) 较为常见，这类疾病的发生率，大约是每4000个新生儿中有一位 神经纤维瘤之遗传方式神经纤维瘤之遗传方式•在遗传上，约有一半的患者是属于显性遗传；亦即，台湾地区约有6000个NF-1的家庭•由于NF-1基因为自体显性遗传，也就是在神经纤维瘤家庭中，一旦此基因产生突变，其家族子代中所有成员皆有50%之机会带有此突变基因 神经纤维瘤基因检测之重要神经纤维瘤基因检测之重要•在这些家族中，神经纤维瘤之症状会不断侵袭这些家族中的家属•同一家族中症状严重程度皆不一样•所以说NF-1突变基因遗传检测对于早期确认神经纤维瘤之疾患是有其必要性的，尤其是对于具有家族性神经纤维瘤之家族成员而言。

Pt.S/FLocationMolecular defectsCodon substitutionMutation typePredicted protein productReference1FExon 2118 A>T AAG>TAGNonsenseK40XThis report2FExon 5492..495delAACT-Frame-shiftAa164, PTC176This report3SExon 6621delT-Frame-shiftAa207, PTC210This report4SExon 91019..1022insTAAC-Frame-shiftAa340, PTC353This report5SExon 111237 T>CTCA>CCAMissenseS413PThis report6SExon 111241 T>GCTC>CGCMissenseL414RThis report7FExon 151721 G>AAGC>AACMissenseS574NFashold et al. 20008FExon 161756..1759delACTA-Frame-shiftAa586, PTC603Fashold et al. 20009FIntron 202409+ 2 T>G-Exon skippingSplice DSThis report10SExon 232994 T>ATAT>TAANonsenseY998XFashold et al. 200011FExon 233114 G>TAGG>AGTMissenseR1038SThis report12SExon 273634..3635delGT, insCCCC-Frame-shiftAa1212, PTC1215This report13FExon 273639..3641delAAT-Frame-shiftAa1213,1214del＂M＂This report14SExon 283826 C>TCGA>TGANonsenseR1276XHeim et al. 199515FExon 293916 C>TCGA>TGANonsenseR1306XPark et al. 199816SExon 314169 T>CCTC>CCCMissenseL1390PThis report17FExon 344614delG-Frame-shiftAa1538, PTC1552This report18SExon 354759..4761delTAT-Frame-shiftAa1587, 1587del＂Y＂This report19FExon 364963 G>AGCA>ACAMissenseA1655TThis report20SExon 375360 C>GACG>ATGMissenseT1787MThis report21SExon 375401 C>TCAG>TAGNonsenseQ1801XThis report22FExon 395792 G>ATGG>TAGNonsenseW1931XThis report23FExon 395843..5844delAA-Frame-shiftAa1948, PTC1954This report242526SFSIntron 41Exon 42Exon 426365 -1 G>A6410 T>A6555delA-TTA>TAA-Exon skippingNonsenseFrame-shiftSplice ASL2137XAa2185, PTC2196Fashold et al. 2000This reportThis report家族性神经纤维瘤之个案家族性神经纤维瘤之个案家族性神经纤维瘤之个案病人正常人病人之父病人之妹Breast cancer & cancer genetics•About 5%-10% of breast and ovarian cancers occur as a result of highly penetrant germline mutations in cancer predisposing genes•At least half of these are due to mutations in the BRCA1 or BRCA2 genes. BRCA1 & BRCA2 genes•BRCA1 and BRCA2 mutation carriers•80-85% lifetime risk for female breast cancer•Lifetime risk for ovarian cancer•BRCA1: 60% by age 80 •BRCA2: 27% by age 80•More than 800 distinct sequence variants have been described in BRCA1 and BRCA2Breast cancerBreast cancer正常型正常型突變型突變型-2突變型突變型-1BRCA1BRCA1基因起始序列基因起始序列ATG→AGGATG→AGG之突变之突变BRCA1 mutationsBRCA1 mutationsBreast cancerBreast cancer60y/060y/0OV CancerOV CancerOV CancerOV Cancer5858Breast Breast cancercancerBreast Breast cancercancer本人58H/T58H/T80 y/o 80 y/o 8y/o 8y/o 4848？？视网膜母细胞瘤•一种罕见的眼部肿瘤，胚胎期视网膜细胞产生病变而成•这些细胞本来会长成眼睛里的感光器，也就是杆细胞与锥细胞，这些细胞感应光线之后，会传送电流信息，经由视神经到脑部•遗传型的视网膜母细胞瘤的患者染色体上Rb基因原就有缺陷，此基因负责对产生一种肿瘤抑制蛋白，此对视网膜细胞的生长失去调节功能而长出肿瘤•侦测Rb基因对分辨遗传与非遗传型的视网膜母细胞瘤，以及产前诊断有很大帮忙视网膜母细胞瘤•偶发性•患病的儿童并无罹患此病的近亲•家族有关（遗传性）•根据资料，患病儿童的家族中不只一人得病，而且常好几代都出现患者 。

视网膜母细胞瘤•在先进国家，视网膜母细胞瘤的所有病例中，约有10%~25%具有家族史•在较落后的国家，如尼日利亚或菲律宾的偏远小岛，眼睛长恶性肿瘤的小孩经常因延误治疗，使得肿瘤发生脑部及眼球外的蔓延，在很小的年龄就死于癌症，这些肿瘤的基因，因而没有机会传递到下一代，所以在落后的国家，反而不易发现具有家族史的病例•在台湾早年，也是类似的情形，绝少发现有家族性病例，•近年来因医药的进步，罹患癌症的病童可以存活到婚娶的年龄，并繁衍下一代；又因健保的实施，罹患癌症的小孩，不致于拖垮家庭的经济，被放弃治疗的孩童已经越来越少，所以家族性病例有越来越多的趋势视网膜母细胞瘤•一个双侧性、遗传性的视网膜母细胞瘤的病人，其子女有50%机会罹病•一对无家族史的父母在生了一个罹癌的小孩后，其下一胎再罹病的机会是2%~5%，如果已有2个罹病的小孩，其下一个子女罹病的机会则提高到50%•一个单侧性无家族史眼癌的病人，其下一代罹病的机会则只有5%•一个双侧性眼癌的病人，他的健康的手足或子女的下一代，仍有2%~6%的机会罹病遗传谘询•遗传而来的视网膜母细胞瘤是以体染色体显性遗传的方式，传给下一代•其遗传基因已被证实存在于第13对染色体。


•
一个单侧性、无家族史视网膜母细胞瘤的患者，其下一代罹病的机会只有5%

•一个双侧性视网膜母细胞瘤的患者，他的健康的手足或子女的下一代，仍有2-6%的机会罹病遗传谘询•遗传型的网膜母细胞瘤与双眼均受侵犯的患者很容易得到次发性癌症，其中以骨肉瘤（骨癌）最多，次常见的则为肺癌与乳癌

•现今已可将网膜母细胞瘤的相关基因Rb基因鉴定出来，对这些Rb基因缺乏或失去功能的病人，更应终生密切追踪，以期早日发现次发性癌症•至于非遗传型病人，以后产生第二种癌症的危险性和一般人大致相同遗传谘询•高危险群的病人家族成员，应该做遗传谘询•如果能经由产前检查之基因鉴定，事先知道胎儿是否罹病，对病人家属将是莫大的福音•由于近年来医学的进步，使得罹患癌症的小朋友有机会可以存活到生育年龄，因此家族性病例偶有发现，不能掉以轻心；否则一旦再生出一个罹病小孩，对整个家族将造成相当大的打击Cerebral Cavernous HemangiomasexonPrimer sequencePCR Length (bp)Anneal Temp(℃)DHPLC Temp(℃)Elution Profile (B %)1FTTC CAA TGG CTA CTT CTA CCT G326565654RAAA ACG TCT TTT AAA TCA GAG C2FTGA CAA AGC TCT TAA TGG GT261565550RGAC TAC AAT GCA TAC AAA TTG C52523FAAA CAA TTT TTA CAG TCC TGT TG280565848RAGA ACA GTC TTG AAA AGA AGG A52524FCAT TTC AGA TGA TCT TTT TAG G286565750RTGT CAT TAC TTG TTA TTC ACT GCT53535FATT GGA TGA CAT TTT CCC TT281565552RAGC CAT CTA ATC GTC TTT CC6FAGC ACA TGA AGT TGA AGG AA292565553RCCC AAA AAG GAA TAA TGA GG7FGAA GTG CAG ACA GTT TAA TAC AAA293565652RCTC AAC AGA TTT TGT GCA TTT8FGCT TTT TCT TTT CCC ATA TT283565452RTAG CAC AAG ACC ATG CAT AA9FCGT TAC TGA AAG CCA TTT GT281565452RCAG GAC TAT AAA TTT AAT CTA CCT CTG10FCAA TGG TAC ATT TTC CTT TCA329565552RAGG TTG GTA CTG TTG TTT TAA CT11FCTG AAC TAT TAT ATT TAG AGC AGA CA261565352RCAC AAT AGT TTA TGA AGT CCA AA12FCCC AAT GTC ATG AAT TTC C233565357RGCT CGG CCA AAA GTA ATAexonPrimer sequencePCR Length (bp)Anneal Temp(℃)DHPLC Temp(℃)Elution Profile (B %)Case numberAgeCCMs locationNumber of CCMs in MRIAssociated diseaseMutation site151Cingulated gyrus, insula,cortex, subcortical white matter9Acoustic neuromac.1846delA240Centrum semiovale, parietal deep white matter6nilc.1846delA316Subcortical white matter1Venous malformationc.1846delA414Frontal parietal cortex and subcortical white matter5nilc.1846delA538Cerebellum, bil. cerebral hemispheres and deep gray matter7nilc.1846delA637Thalamus1hepatomac.587C>G (Ala->Gly)750Medulla, subcortical white matter3nilc.535C>G (Arg->stop)X-linkedX-linkedHemophilaHemophila•血友病是一种遗传的血科疾病，患者的血液中缺少一种凝血因子，以致受伤后，伤口的血液凝固比常人较慢，故容易因失血过多，而导致生命危险。

•血友病病人主要是男性，因为女性另有一个相对的正常遗传因子，故不会发病，只会将病变因子遗传下一代血友病血友病 ( Haemophilia )( Haemophilia )•不论不论A A型或型或B B型血友病型血友病, ,携带血友病基因的女性有二携带血友病基因的女性有二分之一的机会传给子女分之一的机会传给子女, ,即儿子有二分之一成为血即儿子有二分之一成为血友病人者友病人者, ,而二分之一的女儿将成为带因者而二分之一的女儿将成为带因者•带因者大都无症状带因者大都无症状, ,且血浆中凝固因子且血浆中凝固因子ⅧⅧ活性大都活性大都正常正常, ,通常只能用分子诊断来做检测通常只能用分子诊断来做检测, ,•以往利用以往利用linkage analysislinkage analysis来筛检来筛检, linkage , linkage analysisanalysis虽然便宜虽然便宜, ,但受限在必须有家族史但受限在必须有家族史, ,即必即必须有病人检体须有病人检体, ,另外还必须考虑重组另外还必须考虑重组(recombinant (recombinant events)events)和和gemline mutationgemline mutation等问题。

等问题•而直接检测基因序列而直接检测基因序列(direct sequence),(direct sequence),虽然敏虽然敏感高感高, ,但花费较高但花费较高, ,且所须时间较长且所须时间较长, , Duchenne Muscular Dystroply Duchenne Muscular Dystroply (DMD) (DMD) •为所有肌肉萎缩症中较常见的一种，通常只发生在男性身上•与人类X染色体上的DMD基因有关•60-65 %属于大片段缺失(deletion)或重复(duplication)突变•其他则可能属于小片段缺失/插入突变 (small deletions/ insertions)或点突变(point mutation) 对于自体隐性遗传疾病而言对于自体隐性遗传疾病而言, ,高效率之带高效率之带因者检验计划及流程为进行产前诊断及预因者检验计划及流程为进行产前诊断及预防疾病发生之唯一途径防疾病发生之唯一途径海洋性贫血是台湾最常见之单一基因自体海洋性贫血是台湾最常见之单一基因自体隐性遗传疾病隐性遗传疾病, ,且是目前唯一能够进行全且是目前唯一能够进行全国性带因者筛检之单一基因疾病国性带因者筛检之单一基因疾病ARARβ- thalassemiaβ- thalassemia•乙型海洋性贫血 (β-Thalassemia) 是一种• 常见的单基因遗传性血液疾病，属自体隐• 性 (autosomal recessive) 遗传。

•台湾大约有 1% 的人民为某种乙型海洋性• 贫血的带因者a-thalassemiaa-thalassemia•甲型海洋性贫血甲型海洋性贫血 (a-Thalassemia) (a-Thalassemia) 是一种常见的是一种常见的单基因遗传性血液疾病，属自体隐性单基因遗传性血液疾病，属自体隐性 (autosomal (autosomal recessive) recessive) 遗传 •台湾大约有台湾大约有 3-5% 3-5% 的人民为某种甲型海洋性贫血的人民为某种甲型海洋性贫血的带因者的带因者筛检成功与否之关键筛检成功与否之关键, ,为是否具备高效率之为是否具备高效率之带因者检验计划带因者检验计划Spinal Muscular Atrophy (SMA)Spinal Muscular Atrophy (SMA)1. 一种脊髓性的肌肉萎缩症: 是因脊髓的前角运动神经元渐进性退化，造成肌肉逐渐软弱无力、萎缩的一种疾病 2.Aotosomal Recessive Inheritance (隐性遗传)3. 也是人类常见的新生儿疾病,仅次于海洋性贫血4. Carrier rate 高达 1/35~1/50。

Rodrigues NR, et al (1995) Hum Mol Genet 4:631 634Spinal Muscular Atrophy (SMA)Spinal Muscular Atrophy (SMA)平均每 5000-10000 个新生儿就有一个得到这种疾病Carrier rate 高达 1/35~1/50SMA SMA 的遗传方式的遗传方式隐性遗传疾病AR全血全血 1-3 ml1-3 mlDHPLC analysis自動化自動化DNA萃取萃取PCRSingle gene disorders detected by Single gene disorders detected by DHPLC-based techniques in our labDHPLC-based techniques in our lab•SMA (SMN1/2 gene)•Thalassemia (a and b globin gene)•HBOC syndrome (BRCA 1/2 gene)•ADPKD (PKD1/2 gene)•Tuberous sclerosis (TSC 1/2 gene)•Achondroplasia and related syndromes (FGFR3 gene)•APC (FAP gene)•HNPCC (Mlh1 , Msh2 gene)•Hemophilia A/B (F8/F9 gene)•DMD/BMD (Dystrophin gene)•Neurofibromatosis (NF1 gene)•Hereditary cavernous angiomas (Krit 1 gene)•Osteogenesis imperfecta (Col 1A1 and 1A2 gene)•Long QT syndrome related gene•others产前胎儿基因诊断产前胎儿基因诊断CVSCVSCVSCVS（绒毛取样术）（绒毛取样术）（绒毛取样术）（绒毛取样术） 显微镜下挑取绒毛株约3-4株以上(置于约500 ul PBS中)送检绒毛细胞培养后约一个25T flask送检AmniocentesisAmniocentesisAmniocentesisAmniocentesis（羊膜穿刺术）（羊膜穿刺术）（羊膜穿刺术）（羊膜穿刺术）1st test → 2 C.C.新鲜羊水，不要离心（约3个工作天发送报告） 2nd test → 羊水细胞大量培养约一个25T flask送检（培养约7天，培养后送达实验室约3个工作天发送报告）CordocentesisCordocentesisCordocentesisCordocentesis（脐带血穿刺）（脐带血穿刺）（脐带血穿刺）（脐带血穿刺） 1-2 C.C.脐血置于EDTA管中送检（约3个工作天发送报告）2 step2 step2 step2 step检验法检验法检验法检验法SMASMA产前胎儿基因诊断产前胎儿基因诊断 Thank you for your Thank you for your attention !!attention !!。