蜂蜜抑菌活性检测方法比较研究——毕业论文.doc

湖 南 农 业 大 学全日制普通本科生毕业论文蜂蜜抑菌活性检测方法比较研究COMPARATIVE STUDY ON DETECTION METHODS OF ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF HONEY学生姓名：学 号：年级专业及班级： 食品质量与安全 指导老师及职称： 学 院：食品科学技术学院湖南·长沙提交日期： 年 月 目 录摘要 1关键词 11前言 11.1选题背景 21.1.1蜂蜜功能 21.1.2蜂蜜产业现状 21.1.3蜂蜜研究现状 31.2研究目的 31.3研究方法 31.4研究意义 42材料与方法 42.1试验材料 42.1.1供试菌种 42.1.2供试蜂蜜 42.1.3主要仪器、器皿及用品 42.1.4培养基 52.2方法 52.2.1菌种的活化及菌液的制备 52.2.2试验平板的制备 52.2.3抑菌试验 52.2.4抑菌圈大小测量 62.3试验方案 62.3.1蜂蜜蜜源对其抑菌活性地影响研究 62.3.2试验平板制作方法的比较研究 62.3.3试验最适菌及其最适浓度研究 62.3.4蜂蜜抑菌活性检测方法比较 63结果与分析 73.1蜂蜜抑菌活性与蜂蜜蜜源的关系 73.2试验平板制作方法比较 73.3试验平板中最适菌体浓度试验结果 83.4蜂蜜抑菌活性检测方法比较结果 114结论 13参考文献 13致 谢 14蜂蜜抑菌活性检测方法比较研究 摘 要：通过比较试验实际操作和结果，获得最佳蜂蜜抑菌活性检测方法，为同行在进行蜂蜜抑菌圈研究选择方法时提供参考。

本试验比较了四种蜂蜜，两种试验平板制作方法，三种供试菌，5种浓度的供试菌菌液，以及K-B法、牛津杯法、打孔法三种抑菌活性检测方法结果表明：洋槐蜜有抑菌活性，用预加菌液倾注平板法制作试验平板、接种菌落数量级约为1×102 CFU/mL的大肠杆菌菌液、采用K-B法做定性试验、打孔法做定量实验为检测蜂蜜抑菌活性的最佳方案 关键词：蜂蜜；抑菌活性；检测方法；比较；The comparative study on test method of antimicrobial activity of honey Abstract: The test was to get the best test method of antimicrobial activity of honey by comparing the test’s pratical experience and result . That way would play a key role in chosing test method of antimicrobial activity of honey in future .The test compared four honey、two making method of test plate、three test bacteria 、five concentrations and three detection method of bacteriostasis activity including K-B method , punch method and oxford cup method. Finally the results show that acacia honey have antimicrobial activity .Using preloading bacteria liquid poured-plate method to make test plate、inoculating Escherichia coli whose colony quantity is about 1×102 CFU/ML、using K-B method to do qualitative test , and the best test scheme、and using punch method to do quantitative test is the best test scheme of antimicrobial activity of honey. Key words :honey; antimicrobial activity ;test method ;comparation1 前言1.1 选题背景1.1.1 蜂蜜功能 蜂蜜是蜜蜂从植物的花中采得的花蜜在蜂巢中酿制的蜜，是人类传统而古老的天然食品和医疗药品,食用和药用历史悠久。

蜂蜜营养丰富、功能强大：蜂蜜中含有丰富的碳水化合物、蛋白质以及少量却优质的维生素、多酚类物质和矿物质，老少皆宜蜂蜜功能多样，例如蜂蜜具有良好的抑菌活性及抗氧化能力，还可以润肠通便、促进酒精分解[1]其中抑菌活性是指某些物质所具有的抑制或杀灭病原微生物的能力在古代，蜂蜜的抑菌功效早就得以验证，如蜂蜜是世界上唯一不会腐败的天然食品；又如4500年前人类就将蜂蜜的抑菌活性应用于伤口治疗，从轻微皮肤感染到刀剑导致的严重割伤，蜂蜜不仅能促进伤口愈合，而且还能减轻伤者的疼痛[2]；又如明代医学家李时珍在《本草纲目》中对蜂蜜的记载为:蜂蜜主要用于治疗心腹邪气和各种痢疾，弥补五脏计等的不足，增加并补足气，止痛解毒，医除各种疾病，调和多种药，长期服用可以强身健体，不容易饥饿，也不容易衰老，延年益寿，其入药的功效有五个:清热, 补中气, 解毒, 润燥,和止痛[3]近年, 国内外的许多学者也已经通过各种试验论证证实了蜂蜜强大的抑菌功能如通过临床指证，蜂蜜在治疗皮肤烧伤或溃烂方面效果显著；又如麦卢卡蜂蜜（Manuka honey）被证实因其具有独特的抑菌活性物质—独麦素，而具有优越的抑菌活性，备受广大消费者的喜爱，是世界上迄今为止发现的两种医疗级蜂蜜之一，被称为新西兰的“国宝”[4]。

1.1.2 蜂蜜产业现状另一方面，麦卢卡蜂蜜抗菌活性的研究及其开发利用的成功非常值得我们借鉴，我国养蜂已有2000多年历史，是蜂蜜生产大国、消费大国及出口大国我国地域广阔、蜜源丰富、人口众多，随着人民生活水平的提高，蜂蜜国内消费市场巨大同时，我国也是世界上第一蜂蜜出口大国，中国蜂蜜占世界蜂蜜总产量四分之一以上然而中国虽为蜂蜜大国，但同时也存在许多问题，假蜜盛行、蜂产品价格严重低估是其中最大问题不仅损坏了蜂农的实际利益，也降低了蜂蜜企业加工技术的投入，失掉市场优势，削弱了中国蜂产品的市场竞争力[5-6]当前虽然我国国家质检总局和国家标准委于2011年批准发布了GB14963-2011《食品安全国家标准--蜂蜜》国家标准，要求企业必须无条件执行，但是仍有很多不良企业用糖浆、甜味素、食用果胶等调制出来的成本只有几块钱的假蜂蜜不仅能够顺利通过国家的标准检测，而且比真蜂蜜更甜更粘稠，以“低价竞争”的方式打乱市场因此国内市场假蜂蜜依旧盛行[7]消费者没有实用的标准作为参考，仅凭观察、品尝，来鉴别蜂蜜的真假、质量的好坏是相当难的由于假蜜泛滥所导致的消费者对蜂蜜产品的不信任，国内的蜂蜜市场情况不容乐观，但事实上蜂蜜产品其实有着稳定的消费需求和巨大的市场容量，仍然有巨大的消费空间尚待开发[8]。

因此研究如何辨别蜂蜜的真假和好坏对于我国蜂产品消费市场的开发十分重要，而且研究蜂蜜独特的抑菌活性是现如今最认可的辨别蜂蜜的真假和好坏的方向1.1.3 蜂蜜研究现状迄今为止蜂蜜的抑菌活性机理的研究有了一定的进展,影响蜂蜜抑菌活性的因素主要有两个方面: 一是蜂蜜的物理特性：如蜂蜜的高渗透压和低酸碱度对大多数菌而言，均不适合其生长二是蜂蜜中所含有的抗菌成分；抗菌成分主要可以划分为过氧化氢类和非过氧化氢类，过氧化氢类通过氧化作用抗菌,非过氧化氢如溶菌酶、苯酚类化合物和黄酮类化合物，可以分别通过各种不同的途径抗菌[9]然而至今为止，蜂蜜的抑菌机制仍然有许多不明白的地方需要进一步研究目前，国际上围绕蜂蜜抑菌机制的研究越来越多因为抑菌试验几乎是研究蜂蜜抑菌机制的必经步骤，因此蜂蜜抑菌试验方法选择的研究十分重要抑菌试验是指在体外通过试验测定样品抑菌能力的一种试验抑菌试验中最常用的方法是抑菌圈法，抑菌圈法又叫扩散法，是利用待测样品在培养基中扩散使其附近的细菌成长受到抑制而形成一个透明圈，即抑菌圈，根据所形成的抑菌圈大小来判定待测药物抑菌效果的一种方法抑菌圈法不仅操作简单、试验成本低、而且成效好，高精度，因此被普遍使用。

目前抑菌圈研究法中使用最多的主要有K-B法（Kirby-Bauer test）、牛津杯法和打孔法三种K-B法即滤纸片法，选用质地均匀的滤纸，灭菌后烘干，浸入待测样品中， 然后放置于平板培养基中培养16~24h后测定抑菌圈大小的一种方法牛津杯法又称杯碟法，选用一定大小的牛津杯，灭菌后烘干，放置于试验平板中，然后往牛津杯中注入一定量的待测样品，培养16~24h后测定抑菌圈大小的一种方法打孔法又称平板打孔法，是指选用一定孔径大小的打孔器，灭菌后烘干，然后在培养基上打孔，往孔中注入一定量的待测样品，培养16~24h后测定抑菌圈大小的一种抑菌活性检测方法[10-11]1.2 研究目的正因为抑菌试验方法多，研究蜂蜜抗菌机制时，抑菌活性检测方法的选择是一个比较麻烦的问题，因此本试验就是以获得蜂蜜抑菌活性最佳检测方法为研究目的的 1.3 研究方法本次试验通过比较荆条花蜜、长白山椴树蜜、五倍子蜜、洋槐蜜四种供试蜂蜜，预加菌液倾注平板法、涂平平板法两种试验平板制做方法，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌这三种供试菌，以十倍比稀释成五个浓度梯度的待测菌液，以及K-B法、牛津杯法和打孔法3种抑菌活性检测方法，获得蜂蜜抑菌活性最佳检测方法.1.4 研究意义本试验以期为同行在进行蜂蜜抑菌活性研究选择方法时提供参考。

首先有利于通过蜂蜜抑菌效果强弱的比较，对蜂蜜质量进行分级，为蜂蜜质量划分标准其次对于未来蜂蜜抗菌机制的进一步研究十分有用，有利于促进新兴蜂蜜保健品的开发，让蜂蜜的商业价值得以更好的发掘和利用如利用其抗菌、促进伤口愈合、减轻伤者疼痛的作用，可以更加充分地利用其在外科创伤治疗方面的价值，或者将其直接应用到抗炎抗菌药物地开发中，开发针对治疗耐药菌的药物[12]目前抑菌试验研究比较多的有天然活性物质、中药材提取物和抗生素类等物质，其抑菌性能在药品、功能食品、保健品和化妆品等行业都是一个重要指标抑菌活性对于蜂蜜来说因此也是一个相当重要的指标抑菌活性好的蜂蜜不但具有作为天然的药品、保健品的应用价值，而且还可以作为抗菌新药源具有更大的开发空间，来解决现如今抗生素的大量使用带来了细菌的抗药性这一时代问题然而目前文献中对于蜂蜜的抑菌机制研究较多，对于蜂蜜抑菌活性检测方法的研究较少，事实上找到一种最方便快捷准确的抑菌活性检测方法，对于日后蜂蜜抑菌机制的进一步研究是十分有益的，将为日后蜂蜜抑菌试验省时省力2 材料与方法2.1 试验材料2.1.1　供试菌种 由14教311试验室提供的大肠杆菌（E.coli）、金黄色葡萄球菌(S. aureus)和枯草芽孢杆菌(B. subtilis)。

2.1.2　供试蜂蜜 本试验所使用的蜂蜜皆是由张家界供销云商股份有限公司提供的、经过加工炼制过的熟蜜包括：荆条花蜜、长白山椴树蜜、五倍子蜜、洋槐蜜精确称取待测蜂蜜10g加入到50mL蒸馏水倍比稀释至0.2g/mL的浓度冰箱保存备用2.1.3　主要仪器、器皿及。