蛋白质的等电点测定和沉淀反应.docx

实验3蛋白质的等电点测定和沉淀反应、目的1、 了解蛋白质的两性解离性质2、 学习测定蛋白质等电点的一种方法3、 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识4、 了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义原理蛋白质是两性电解质在蛋白质溶液中存在下列平衡:COOHy蛋白质分子COO"COO-PZCOOH阴离子pH>pI+ OH获性离子阳离子pH = plpH

蛋白质的沉淀反应可分为两类1）可逆的沉淀反应 此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的 因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来溶剂中，并保持其天然性质而不变性如大多数蛋白 质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质提纯蛋白质时，常利用此 类反应2）不可逆沉淀反应 此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀， 不再溶于原来溶剂中加热引起的蛋白质沉淀与凝固蛋白质与重金属离子或某些有机酸的 反应都属于此类蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出因此变 性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性三、材料、试剂与器具（一）材料新鲜鸡蛋（二）试剂1、0.4%酪蛋白醋酸钠溶液 200ml取0.4g酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细地研磨，将所得的蛋白质悬胶液移入200mL锥 形瓶内，用少量40—50°C的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内加入10mL lmol/L 醋酸钠溶液把锥形瓶放到50C水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止 将锥形瓶内的溶液全部移到100mL容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻塞，混匀2、 1.00mol/L 醋酸溶液 100mL3、 0.10 mol/L 醋酸溶液 300mL4、 0.01 mol/L 醋酸溶液 50mL5、 蛋白质溶液 500mL5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液（新鲜鸡蛋清 ：水=1:9）6、 pH4.7 醋酸—醋酸钠的缓冲溶液 100mL7、 3%硝酸银溶液 10mL8、 5%三氯乙酸溶液 50mL9、 95%乙醇 250mL10、 饱和硫酸铵溶液 250mL11、 硫酸铵结晶粉末 10000mL12、 0.1mol/L 盐酸溶液 300mL13、 0.1mol/L 氢氧化钠溶液 300mL14、 0.05mol/L 碳酸钠溶液 300mL15、 甲基红溶液 20mL（三）器具1、水浴锅 2、温度计3、200mL锥形瓶 4、100mL容量瓶5、吸管 6、试管及试管架 77、乳钵四、操作步骤试管号蒸馏水（mL）0.01 mol/L 蜡酸(mL)0. 1 mol/L 蜡酸(mL)1. 0 mol/L 蜡 酸(mL)18.40.6-——28.7-0.3——38.0-1.0——47.4--1.6一）酪蛋白等电点的测定（1）取同样规格的试管4 支，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀。

一）酪蛋白等电点的测定（2）向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液 1mL， 加一管，摇匀一管此时 1、2、3、4 管的 pH 依次为 5.9、 5.5、4.7、3.5观察其混浊度静置 10 分钟后，再观察其混浊度 最混浊的一管pH即为酪蛋白的等电点二）蛋白质的沉淀及变性1、 蛋白质的盐析 无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）的浓溶液能析出蛋白质盐 的浓度不同，析出的蛋白质也不同如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出 由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用 是可逆过程加蛋白质溶液5mL于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出 球蛋白的沉淀倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，为什么？将管内容物过滤， 向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止此时析出沉淀为清蛋白取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解2、 重金属离子沉淀蛋白质 重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物取1支试管，加入蛋白质溶液2mL,再加3%硝酸银溶液1—2滴，振荡试管，有沉淀 产生放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？3、 某些有机酸沉淀蛋白质 取1支试管，加入蛋白质溶液2mL,再加入1ml5%三氯乙 酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。

放置片刻倾出清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀 是否溶解4、 有机溶剂沉淀蛋白质 取1支试管，加入2mL蛋白质溶液，再加入2mL95%乙醇 观察沉淀的生成（如果沉淀不明显，加点NaCl,混匀5、乙醇引起的变性与沉淀 取3支试管，编号依下表顺序加入试剂：\试剂^\（mL） 管号\蛋白质 溶液0.1mol/L 氢氧化钠溶液0.1mol/L 盐酸溶液95%乙醇PH4.7缓冲溶液11————11211——1——31——11——振摇混匀后，观察各管有何变化放置片刻向各管内加入水8毫升，然后在第2， 3号 管中各加一滴甲基红，再分别用0.1mol/L醋酸溶液及0.05mol/L碳酸钠溶液中和之观察 各管颜色的变化和沉淀的生成每管再加 0.1mol/L 盐酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解解 释各管发生的全部现象五、注意事项 等电点测定的实验要求各种试剂的浓度和加入量必须相当准确六、实验报告 以表格形式总结实验结果，包括观察到的现象，分析评价实验结果七、思考题1、 什么是蛋白质的等电点？2、 在等电点时，蛋白质溶液为什么容易发生沉淀？。