减毒沙门氏菌携带siRNASTAT3质粒对小鼠前列腺移植癌的治疗作用.doc

减毒沙门氏菌携带siRNA STAT3质粒对小前列腺移植癌的治疗作用作者：刘喜东周悦周姝含曹群王芳魏雁虹周庆伟赵雪剑【摘要】冃的观察减毒沙门氏菌携带siRNA STAT3质粒对小鼠 前列腺移植癌的治疗效果，分析其作用机制方法构建小鼠前列腺移 植癌模型，随机分组，将转化有siRNA STAT3质粒的减毒沙门氏菌 经局部注射到模型构建成功的小鼠体内观察小鼠…般状态，记录肿 瘤体积的变化，RT PCR和Westernbol t方法分析STAT3及其下游基 因Bel 2、c Myc、HiFl、cyclinD 1的mRNA和蛋白表达水平，铺 板法观察菌群分布，HE染色观察肿瘤的形态学变化，免疫组化检查 STAT3. HiFl及PCNA蛋白表达情况结果①小鼠前列腺移植癌模型构 建成功，携带有siRNA STAT3质粒沙门氏菌治疗组移植性前列腺癌瘤体生长受到明显抑制，瘤重减轻；②铺板法检测菌群分布显示减毒 沙门氏菌具有嗜肿瘤特性且在肿瘤内长期存活；肝内分布次之，再次 为肺，在脾中分布最低；③pGC Si STAT3治疗组肿瘤组织的STAT3mRNA和蛋白表达明显降低；其下游基因Bel 2、c Myc的mRNA及HiFl、cyclinDl蛋口的表达水平都不同程度的受到抑制；④免疫组 织化学结果显示pGC Si STAT3治疗组肿瘤组织的STAT3、HiFl 及PCNA表达下调。

结论以减毒沙门氏菌作为运载体携带siRNA STAT3质粒通过调控STAT3下游基因表达，诱导凋亡，对小鼠移植性 前列腺癌具有显著的抑瘤作用关键词】前列腺癌；减毒沙门氏菌；STAT3； RNA干涉L Abstract 】Objecti veToobservetherapeuti ceffi cacyofattenuatedsaimonel 1ac arryingthesiRNAStat3plasmi dtowardstranspl antedprostati ccancerofmouse・ Method sTheprostatictranspla.ntedmodelofmousewa.sbuiIt, thentheattenua tedsalmonellawithtransformedplamidofsiRNASTAT3wasi njectedi ntolocalbodi esofmousemodelsconstuctedsucces sfully. Thegeneralstatusofthemousewereobservedandthechangingv olumesoftumorswererecorded・ ThentheexpressionofmRNAandprotein levelsofSTAT3a.nditsdownstreamgenessucha.sBcl 2, cMyc, HiFl, cyclinDlwereanalyzedbyRTPCRandWesternblot, apoptosisoftumorcel1swastestedbyFloweytome try. Results(1)Prostatictrnasplantedcancermondelofmousewerema desuccessful 1y, andthegrowthoftumorsinthegrouptreatedwi thsalm onellaofsiRNASTAT3plasmidweresuppressedobviouslyandtheweightsoftumorswere 1essened;(2)Theapoptoticratesofthecancergrouptreatedwi thpGCSi STAT3,pGC SiScrambleandgroupmockwere29・ 1%, 14. 7%and8・ 5%, respective!y. (3)T hemRNAandproteinexpressionsofSTAT3inthetumortissuetreatedwithpGC SiSTAT3weredecreasedgreat1y. ThemRNAexpressionsofdowntreamgenes ,suchasBcL 2,cMycwereinhibi tedinadifferentdegree, andtheproteinexpressionso fHiFl, cyclinDlwerejustthesame・ ConclusionsRegulatingexpressio nofSTAT3toi nduceapoptosi sbymeansofplasmi dofsi RANSTAT3withthetra.nsporterofattenuatedsalmonella.couldsuppressth etransplantedprostaticcancersofmouse.【 Keywords 】Prostaticcancer;Attenuatedsalmonel la;STAT3;RNAinterfere信 号 转 导 和 转 录 活 化 因 子 (SignalTransducerandActivatorofTranscription, STATs)家族是1 种存在于胞浆并在激活后能够转入核内与DNA结合的蛋白家族，具有 信号转导和转录调控双重功能。

在正常情况下，STAT信号途径的激活 是一个瞬时的过程，并受严密调控，其持续激活则与细胞的恶性转化 进程密切相关〔1)在不同类型的肿瘤中，激活的STAT家族成员并不 完全相同，其中STAT3与肿瘤的发生发展关系最为密切，目前公认为 它是癌基因STAT3并不直接导致肿瘤的发生，而是通过对其下游靶 基因的调控来影响肿瘤的进程STAT3的下游靶基因如Bel XI八Bel2、Mcl 1、CyclinDl. c Myc、c Jun、Fas 和 VEGF 等都与细 胞增殖与凋亡密切相关（2）本实验以小鼠移植性前列腺癌为模型， 以减毒沙门氏菌作为载体，携带siRNA STAT3质粒，观察其对小鼠 前列腺癌的治疗效果，探索其作用机制1材料与方法1.1动物、试剂及仪器健康雄性C57BL/6近交系小鼠30只,鼠龄10w,体重20〜24g, 由吉林大学动物中心提供；减毒鼠沙门氏菌phoP/phoQ突变株及携带 有Si STAT3质粒（人鼠同源）S. TyphiTy21a人用疫苗株由吉林大 学中日联谊医院前列腺疾病预防和治疗中心提供；前列腺癌M 1细胞株购自上海细胞所；DNAMarkerDL2000, lkbLadderDNAMarker 均为 Takara公司产品。

引物合成及测序由上海生工生物工程技术服务公司 完成高保真TaqDNA聚合酶、二氨基联苯胺（DAB）、曲拉通（Triton） X 100、dNTP、逆转录酶及质粒提取和纯化试剂盒购自Promega公司；兔抗人STAT3 —抗、羊抗兔辣根过氧化物酶标记的二抗购于SantaCruz 公司;RNA酶购于美国Ambion公司o Trizol （Invitrogen公司,美国）； 超净工作台（YZ 875苏州净化设备厂）；电泳仪（Bio rad,美国）;凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）;全自动显微镜数码摄像系统、 相差显微镜、荧光显微镜（OLYMPUS,日本）；流式细胞仪（美国）；PCR 扩增仪(GeneAmp,美国)；自动C02恒温培养箱(SANYO, Fl本)；蛋 白质电泳装置及转移系统(Bio rad,美国)1. 2小鼠前列腺癌移植模型的建立取对数牛长期的小鼠前列腺癌RM 1细胞,用胰酶消化后配制成 细胞浓度为5X106个/ml的悬液,取0. 2ml注射于雄性C57BL/6小鼠 腋下，2w开始成瘤，3w后肿瘤生长至直径lcni大小时备用将肿瘤组 织取出，放置在低温、无菌的0.9%生理盐水中，在10倍显微镜下切 割成直径(1.20. 2)mm大小的肿瘤块。

再取体重20〜24g的雄性 C57BL/6小鼠，用1%戊巴比妥钠0. lnil行腹腔注射麻醉剪开小鼠背 部皮肤，将切好的瘤块嵌入皮下并用8 0外科无创缝线缝合，待 小鼠苏醒后放回笼中1・3实验动物分组及给药取术后10d手术成功的前列腺癌移植瘤模型小鼠30只，随机分为 Mock 未治疗组，pGC Si Scramble 组，pGC Si STAT3 组，每 组10只将含质粒的沙门氏菌分别接种于含Kana的LB平板(50mg/L) 和含Amp的LB平板(50mg/L)，倒置平皿37C培养16〜20h,分别挑 菌接种于200ml含Kana和含Amp的LB培养液中，置于37C恒温摇床, 测A值为0. 6时停止培养每组肿瘤局部注射携带相应组质粒的减毒 沙门氏菌，分2点注射，每点50U 1,细菌浓度为109cfu/100ul,在 治疗后隔日1次用精密卡尺测量肿瘤最大长径和短径，并计算肿瘤体 积，观察肿瘤体积的变化体积=0. 52 X长径X短径21.4将重组质粒电转化入鼠减毒沙门氏菌phoP/phoQ突变株用枪头挑取单克隆phoP/phoQ菌菌落，制备感受态细胞利用电 转化的方法将重组质粒转入鼠减毒沙门氏菌phoP/phoQ突变株。

1. 5铺板法检测菌群分布铺板为无菌状态下取肿瘤、脾脏、肝脏和肺脏各40mg,以2nd冷 的磷酸盐缓冲液(PBS)研磨后稀释10倍，取500 u 1接种到含Amp 的LB平皿，37C过夜,次日观察形成的单个克隆数进行定量分析1・6肿瘤病理组织学观察取肿瘤组织作病理切片，苏木素 伊红(HE)染色观察肿瘤组织 的病理变化oSTAT3＞缺氧诱导因子1 (HIF 1)、增殖细胞核抗原(PCNA) 免疫组织化学染色组织切片脱蜡后水洗，蒸惚水洗，PBS洗3%H202 温育lOmin后自來水充分水洗，蒸馅水洗，PBS洗热抗原修复或消 化，将切片置入抗原修复液，用微波炉加热至沸腾10〜20s, PBS充分 洗加正常血清封闭20niin,弃血清后直接加兔抗鼠STAT3、HIF 1、 PCNA 一抗1 ： 500,室温lh, PBS充分洗加1 ： 2000稀释的羊抗兔辣 根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育30min, PBS充分洗，DAB显色， 电子显微镜观察在肿瘤细胞质内出现棕黄色颗粒，且着色强度高于背 景非特异性染色者判定为阳性1. 7肿瘤组织基因及蛋白质水平检测①Trizol法提取总RNA及逆转录反应：用Trizol试剂提取肿瘤 组织RNA,用紫外分光光度计测量0D260和0D280,计算0D260/0D280 的比值，留取比值在1.8-2. 0的样本进行逆转录。

RNA定量：RNA浓 度(u g/ml) =00260X40X100,取 10ug 总 RNA, Oligo 为引物进行逆 转录②PCR(PolymeraseChainReaction):应用小鼠 B actin 引物进行PCR,鉴定cDNA模板质量B actin引物序列：正义5’ CTGGGACGACATGGAGAAAA37 ；反义 5’ AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC37 ,扩 增片段600bp； PCR条件:94C变性3min, 94C变性30s, 55C退火 30s, 72C延伸30s, 30个循环，最后72C延伸5mino扩增产物经1% 琼脂糖凝胶电泳后经凝胶成像系统拍照应用小鼠STAT3引物进行PCR, STAT3引物序列：正义5’TTGCCAGTTGTGGTGATC3z ；反义 5’ AGACCCAGAAGGAGAAGC3,扩增的耳的片段为 315bp； PCR 条件：94C30s, 55C30s, 72Clmin, 30 个 循环后72C延长5mino应用小鼠Bel 2引物进行。