基因治疗课件.ppt

第第2020章章 基因治疗基因治疗一、概念：n经典的基因治疗：经典的基因治疗：指正常的基因整合入指正常的基因整合入细胞基因组以校正或置换致病基因的一细胞基因组以校正或置换致病基因的一种治疗方法种治疗方法n广义的基因治疗：广义的基因治疗：将某种遗传物质转移将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法以达到治疗疾病目的的方法基因治疗§基因治疗分类基因治疗分类Ø体细胞(somatic cell)(somatic cell)基因治疗Ø生殖细胞(germline)(germline)基因治疗v只限于某一体细胞的基因的改变v只限于某个体的当代v对缺陷的生殖细胞进行矫正v当代及子代基因治疗￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿1973年第一例人体实验年第一例人体实验￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿1978年第二例基因治疗实验年第二例基因治疗实验￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿基因治疗动物实验广泛开展基因治疗动物实验广泛开展￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿Dr￿Anderson（（1980））首首先先阐阐明明基基因治疗前景和发展方向因治疗前景和发展方向￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿Rosenberg（（1990））利利用用逆逆转转录录病病毒毒将将基基因因导导入入肿肿瘤瘤浸浸润润淋淋巴巴细细胞胞（（TIL）），，并并将将TIF输输回回体体内内，，TIF集集中中在在肿肿瘤瘤部部位位，，表达表达neoR。

基因治疗 1990年年9月月14日日：：第第一一例例正正式式批批准准的的基基因因治治疗实验开始进行疗实验开始进行 （（美美国国，，世世界界上上开开展展基基因因治治疗疗最最早早的的国国家家））大大规模进行基因治疗临床实验必须经历以下阶段：规模进行基因治疗临床实验必须经历以下阶段： 体外试验和动物试验体外试验和动物试验 I期临床试验期临床试验——6---10名志愿者名志愿者 II期临床试验期临床试验——20---30名志愿者名志愿者 III期临床试验期临床试验——充分分析疗效、安全性充分分析疗效、安全性 中国中国 1991年年7月开始进行基因治疗试验月开始进行基因治疗试验基因治疗 一、基因治疗的策略一、基因治疗的策略The Strategy of Gene Therapy基因治疗 （一）基因置换（（一）基因置换（gene replacementgene replacement）） 定义：定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，以导入的正常基因置换基因组内原有过定位重组，以导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因。

的缺陷基因 目的目的：将缺陷基因的异常序列进行矫正将缺陷基因的异常序列进行矫正 对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变不涉及基因组的任何改变 基因治疗n又称为基因打靶(gene￿targeting）n定点整合的条件:转导基因的载体与染色体上的DNA具有相同的序列带有目的基因的载体就能找到同源重组的位点，进行部分基因序列的交换，使基因置换这一治疗策略得以实现基因同源重组技术基因同源重组技术基因治疗n要实现基因置换，需要采用同源重组技术使相应的正常基因定向导入受体细胞的基因缺陷部位n定向导入的发生率约1/100万，采用胚胎干细胞培养的方法，这种同源重组的检出率最高可达1/10基因治疗基因置换必要条件：基因置换必要条件：1、对导入的基因及其产物有详尽的了解2、外来基因能有效地导入靶细胞3、导入基因能在靶细胞中长期稳定存在4、导入基因能有适度水平的表达5、基因导入的方法及所用载体对宿主细胞安全无害基因治疗（二）（二） 基因添加基因添加 基因添加或称基因增补基因添加或称基因增补（（gene augmentationgene augmentation））: : 通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。

基因类型类型: :n在在有有缺缺陷陷基基因因的的细细胞胞中中导导入入相相应应的的正正常常基基因因，，而而细细胞胞内内的的缺缺陷陷基基因因并并未未除除去去，，通通过过导导入入正正常常基因的表达产物，基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能补偿缺陷基因的功能；；n向向靶靶细细胞胞中中导导入入靶靶细细胞胞本本来来不不表表达达的的基基因因，，利利用其表达产物达到治疗疾病的目的用其表达产物达到治疗疾病的目的基因治疗基因干预( (gene interferencegene interference) ) 指采用特定的方式抑制某个基因的表达，指采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因而使之不表达，以达到或者通过破坏某个基因而使之不表达，以达到治疗疾病的目的治疗疾病的目的1.反义核酸：反义核酸： 封闭基因表达封闭基因表达2.核酶：核酶： 裂解特异的靶裂解特异的靶mRNA3.RNA干涉技术：干涉技术：（三）基因干预（三）基因干预基因治疗（四）自杀基因治疗（四）自杀基因治疗n自自杀杀基基因因治治疗疗: :恶恶性性肿肿瘤瘤基基因因治治疗疗的的主主要要方方法法之一。

之一n原原理理: :将将“自自杀杀”基基因因导导入入宿宿主主细细胞胞中中，，这这种种基基因因编编码码的的酶酶能能使使无无毒毒性性的的药药物物前前体体转转化化为为细细胞胞毒毒性性代代谢谢物物，，诱诱导导靶靶细细胞胞产产生生“自自杀杀”效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的基因治疗自杀基因的作用机制 基因治疗☻TK/GCV 单单纯纯疱疱疹疹病病毒毒（（herps simplex virus, HSV））Ⅰ型型胸胸苷苷激激酶酶（（thymidine kinase, tk））基基因因编编码码胸胸苷苷激激酶酶 ，， 特特 异异 性性 地地 将将 无无 毒毒 的的 核核 苷苷 类类 似似 物物 丙丙 氧氧 鸟鸟 苷苷（（ganciclovir, GCV））转转变变成成毒毒性性GCV三三磷磷酸酸核核苷苷，，后者能抑制后者能抑制DNA聚合酶活性，导致细胞死亡聚合酶活性，导致细胞死亡☻CD/5-FC 大大 肠肠 杆杆 菌菌 胞胞 嘧嘧 啶啶 脱脱 氨氨 酶酶 （（ cytosine deaminase, CD））基基因因，，在在细细胞胞内内将将无无毒毒性性5-氟氟胞胞嘧嘧啶啶（（5-FC）转变成毒性产物）转变成毒性产物5-氟尿嘧啶（氟尿嘧啶（5-FU）。

1.1.自杀基因系统自杀基因系统5-5-氟尿嘧啶通过氟尿嘧啶通过竞争性抑制竞争性抑制胸苷酸合酶胸苷酸合酶的活性，从而的活性，从而抑制脱氧胸苷三磷酸的合成抑制脱氧胸苷三磷酸的合成基因治疗 旁旁观观者者效效应应: :“自自杀杀基基因因”治治疗疗不不仅仅使使转转导导了了“自自杀杀基基因因”的的肿肿瘤瘤细细胞胞在在用用药药后后被被杀杀死死，，而而且且与与其其相相邻邻的的未未转转导导“自自杀杀基基因因”的的肿肿瘤瘤细细胞也被杀死胞也被杀死 2. 2. 旁观者效应旁观者效应基因治疗（五）基因免疫治疗（五）基因免疫治疗 通过将抗癌免疫增强细胞因子或通过将抗癌免疫增强细胞因子或MHCMHC基因导基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应Ø 基因修饰肿瘤细胞的疫苗疗法基因修饰肿瘤细胞的疫苗疗法Ø 基因修饰基因修饰TILTIL的过继免疫疗法的过继免疫疗法Ø 免疫增强基因疗法免疫增强基因疗法Ø 原位修饰肿瘤免疫原性的基因疗法原位修饰肿瘤免疫原性的基因疗法基因治疗二、基因治疗的必要条件二、基因治疗的必要条件1.发病机制在发病机制在DNA水平上已经清楚；水平上已经清楚；2.要转移的基因已经克隆分离，其表达产物要转移的基因已经克隆分离，其表达产物有详尽的了解；有详尽的了解；3.该基因正常表达的组织可在体外进行遗传该基因正常表达的组织可在体外进行遗传操作；操作；基因治疗1.外源基因可有效导入靶细胞外源基因可有效导入靶细胞2.外源基因能在靶细胞中长期稳定存留外源基因能在靶细胞中长期稳定存留3.导入基因能适量表达导入基因能适量表达4.导入基因的方法及载体对宿主细胞安全无害导入基因的方法及载体对宿主细胞安全无害理想的基因治疗还必须：理想的基因治疗还必须：基因治疗二、基因转移技术二、基因转移技术￿The Technique of Gene Transfer基因治疗基因治疗的两种途径基因治疗的两种途径载体载体目的基因目的基因in vivoex vivo靶细胞基因治疗￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿基因治疗途径基因治疗途径1、间接体内治疗途径（、间接体内治疗途径（ex vivo））￿￿￿￿￿￿￿将靶细胞在体外导入外源基因及体外增殖、筛选、将靶细胞在体外导入外源基因及体外增殖、筛选、药物处理或其他操作后，再输回患者体内（安全、易药物处理或其他操作后，再输回患者体内（安全、易控制但操作复杂）控制但操作复杂）2、直接体内治疗途径（、直接体内治疗途径（in vivo）） 将目的基因体内直接转移到靶细胞，所用载体必须将目的基因体内直接转移到靶细胞，所用载体必须具有特异的导向性和转移效率。

操作简单但疗效短、具有特异的导向性和转移效率操作简单但疗效短、免疫排斥等）免疫排斥等）基因治疗 基因转移基因转移(gene transfer)(gene transfer)技术：技术： 1.1.病毒介导的基因转移系统病毒介导的基因转移系统 2.2.非病毒介导的基因转移系统非病毒介导的基因转移系统基因治疗 1.1.病毒介导的基因转移系统病毒介导的基因转移系统 病毒载体病毒载体介导的基因转移效率较高，因介导的基因转移效率较高，因此它也是使用最多的基因治疗载体据统计，此它也是使用最多的基因治疗载体据统计，有有72%72%的临床实验计划和的临床实验计划和71%71%的病例使用了病的病例使用了病毒载体，其中用得最多的是逆转录病毒载体毒载体，其中用得最多的是逆转录病毒载体基因治疗RetrovirusRetrovirus （（1 1）逆转录病毒）逆转录病毒 基因治疗基因治疗（（1 1）两端各有一长末端重复序列）两端各有一长末端重复序列LTRLTR 逆转录病毒前病毒的结构特点逆转录病毒前病毒的结构特点 （（2 2））LTRLTR由由U3U3、、R R和和U5U5三部分组成。

三部分组成 (1) (1)在在U3U3内有增强子和启动子；内有增强子和启动子； (2)U3(2)U3和和U5U5两两端端分分别别有有病病毒毒整整合合序序列列(IS) (IS) ；； (3)(3)在在R R内还有内还有poly(A)poly(A)加尾信号加尾信号 基因治疗（（3 3）病毒有三个结构基因）病毒有三个结构基因(1)gag(1)gag基因，编码核心蛋白及属特异性抗原；基因，编码核心蛋白及属特异性抗原；(2)pol(2)pol基因，编码逆转录酶；基因，编码逆转录酶；(3)env(3)env基基因因，，编编码码病病毒毒外外壳壳或或包包膜膜糖糖蛋蛋白白( (包包括括外膜糖蛋白和穿膜蛋白外膜糖蛋白和穿膜蛋白) ) （（4 4））5ˊ5ˊ端端LTRLTR下下游游有有一一段段病病毒毒包包装装所所必必需需的的包包装装信信号号序序列列（（ψψ）及剪接供体位点）及剪接供体位点(SD)(SD)和剪接受体位点和剪接受体位点(SA)(SA) 逆转录病毒前病毒的结构特点逆转录病毒前病毒的结构特点 基因治疗（（5 5））含含有有负负链链DNADNA转转录录的的引引物物结结合合位位点点(PBS)(PBS)和和正正链链DNADNA转转录录的引物结合位点的引物结合位点(PPT)(PPT)。

逆转录病毒前病毒的结构特点逆转录病毒前病毒的结构特点 基因治疗构成逆转录病毒介导的基因转移系统构成逆转录病毒介导的基因转移系统——逆转录病毒载体逆转录病毒载体由两部分组成：由两部分组成： (1) (1)保留病毒颗粒的包装信号而缺失病毒蛋白基因保留病毒颗粒的包装信号而缺失病毒蛋白基因基因治疗 (2) (2) 辅辅助助细细胞胞株株( (如如PA317)PA317)：：它它由由缺缺陷陷型型逆逆转转录录病毒感染构建而成病毒感染构建而成基因治疗Retroviral￿packaging￿systemRetroviral￿packaging￿system基因治疗LTRLTRgaggagpolpolenvenvLTRLTRGagGagGagGag蛋白蛋白蛋白蛋白PoLPoLPoLPoL蛋白蛋白蛋白蛋白EnvEnvEnvEnv蛋白蛋白蛋白蛋白包装细胞系包装细胞系包装细胞系包装细胞系LTRLTRLTRLTR靶细胞靶细胞靶细胞靶细胞目的基因标记基因LTRLTRφ φ φ φLTRLTR目的基因标记基因1 12 23 34 45 5假病毒颗粒的产生并感染靶细胞逆转录病毒载体重组逆转录病毒(核酸部分只能是逆转录病毒载体)辅病毒辅病毒基因治疗 逆转录病毒载体的特点逆转录病毒载体的特点 ①①逆转录病毒包膜上由逆转录病毒包膜上由envenv编码的糖蛋白，能够被许多哺乳编码的糖蛋白，能够被许多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别，从而使逆转录病毒携带动物细胞膜上的特异性受体识别，从而使逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。

的遗传物质高效地进入靶细胞②②逆转录病毒结构基因逆转录病毒结构基因gaggag、、envenv和和polpol的缺失不影响其他部分的缺失不影响其他部分的活性③③前病毒可以高效整合至靶细胞基因组中，有利于外源基因前病毒可以高效整合至靶细胞基因组中，有利于外源基因在靶细胞中的永久表达在靶细胞中的永久表达④④包装好的假病毒颗粒（包装好的假病毒颗粒（携带目的基因的重组逆转录病毒载携带目的基因的重组逆转录病毒载体体）以芽生的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中，易于）以芽生的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中，易于分离制备分离制备 基因治疗 逆转录病毒载体的主要缺点逆转录病毒载体的主要缺点 Ø随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危险；险；Ø逆转录病毒载体的容量较小，只能容纳逆转录病毒载体的容量较小，只能容纳7 kb7 kb以以下的外源基因下的外源基因基因治疗 （（2）腺病毒）腺病毒(adenovirus，，AV)载体载体 腺病毒是一种大分子(36 kb)双链无包膜双链无包膜DNADNA病毒病毒。

它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中 腺病毒宿主细胞范围广，可感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等 基因治疗基因治疗腺病毒的优点腺病毒的优点1.1.基因导入效率高，对人类安全；基因导入效率高，对人类安全；2.2.宿主范围广；宿主范围广；3.3.基因转导与细胞分裂无关；基因转导与细胞分裂无关；4.4.重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注；入或气管内滴注；5.5.腺病毒载体容量较大，可插入腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb7.5 kb外源基因；外源基因；基因治疗 腺病毒载体缺点腺病毒载体缺点4.4.靶向性差靶向性差 1.1.不能整合到靶细胞的基因组DNA中分裂增殖快的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢失的机会增多，表达时间相对较短2.宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂3.有两个环节可能产生复制型腺病毒1)腺病毒产生过程中与293辅助细胞内E1区序列发生同源重组；(2)腺病毒载体与被治疗的患者体内已感染的野生型腺病毒，甚至乳头瘤病毒、巨细胞病毒发生重组。

基因治疗（（3 3））腺病毒相关病毒载体（腺病毒相关病毒载体（AVV) 腺病毒相关病毒腺病毒相关病毒(adenovirus associated virus(adenovirus associated virus，，AAV)AAV)是是一类一类单链线状单链线状DNADNA缺陷型病毒缺陷型病毒其基因组其基因组DNADNA小于小于5 kb5 kb，无包膜，外形为裸露的，无包膜，外形为裸露的2020面体颗粒面体颗粒AAVAAV不能独立复不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性则只能建立溶源性潜伏感染潜伏感染AAV Virus Particles基因治疗Structure of AAV Virus Genomic DNAREP:病毒复制基因, CAP:编码衣壳蛋白的基因基因治疗AAV的特点的特点● 以潜伏感染为主；● 病毒基因组与细胞共存；● 只要宿主细胞正常，AAV基因表达就处于抑制而维持潜伏状态；● 若细胞受刺激，表达应激基因，AAV基因表达从而使AAV病毒复制；● 产生子代病毒并释放，又感染新的细胞，建立新的潜伏状态。

基因治疗 AAV载体是目前正在研究的一类新型安全载体，它对人类无致病性 AAV可以高效定点整合至人19号染色体的特定区域19q13.4中，并能较稳定地存在 这种靶向定点整合可以避免随机整合避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源基因可以持续稳定表达，并可受到周围基因的调控，兼具逆转录病毒载体和腺病毒载体两者的优点 基因治疗 AAV载体的缺陷：载体的缺陷： AAV载体容量小，目前最多只能容载体容量小，目前最多只能容纳纳5 kb外源外源DNA片段；片段；感染效率比逆转录病毒载体低感染效率比逆转录病毒载体低在在40%-80%的成人中存在过感染，的成人中存在过感染，可能会引起免疫排斥可能会引起免疫排斥基因治疗基因治疗 2.2.非病毒载体介导的基因转移系统非病毒载体介导的基因转移系统 （（1 1）脂质体介导的基因转移技术）脂质体介导的基因转移技术 脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。

基本原理基本原理: :利用阳离子脂质体单体与利用阳离子脂质体单体与DNADNA混合后，可混合后，可以自动形成包埋外源以自动形成包埋外源DNADNA的脂质体，然后与细胞一起孵育，的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源即可通过细胞内吞作用将外源DNADNA（即目的基因）转移至（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达细胞内，并进行表达 基因治疗 脂质体介导的基因转移示意图基因治疗脂质体介导法缺点脂质体介导法缺点：脂质体介导进入靶细胞内，易被单核-吞噬细胞系统选择性吞噬、降解基因治疗 （（2 2）受体介导转移技术）受体介导转移技术 将DNA与细胞或组织亲和性的配体偶联，可使DNA具有靶向性这种偶联通常通过多聚阳离子（如多聚赖氨酸）来实现多聚阳离子与配体共价连接后，又通过电荷相互作用与带负电荷的DNA结合，将DNA包围，只留下配体暴露于表面这样形成的复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮，从而将外源DNA导入靶细胞缺点：受体介导的缺点：受体介导的DNADNA通常进入细胞溶酶体内被降解通常进入细胞溶酶体内被降解基因治疗受体介导转移技术示意图基因治疗 （（3 3）基因直接注射技术）基因直接注射技术 不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露基因不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露基因DNADNA注入动物肌肉或某些器官组织内。

注入动物肌肉或某些器官组织内 动物实验表明：接受注射外源动物实验表明：接受注射外源DNADNA的小鼠能够按其的小鼠能够按其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久 1.1.将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加30%30%～～40%40%；； 2.2.将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素；糖尿病所缺少的胰岛素； 3.3.肌内注射凝血因子肌内注射凝血因子ⅨⅨ基因，可产生血友病所需基因，可产生血友病所需的凝血因子等等的凝血因子等等基因治疗 基因直接注射法的优点基因直接注射法的优点1.1.制备具有调控部件的质粒制备具有调控部件的质粒DNADNA重组体的技术较容易；重组体的技术较容易；2.2.排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；3.3.导入的基因不需整合即可表达，避免了逆转录病毒载体导入的基因不需整合即可表达，避免了逆转录病毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆转的缺点；导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆转的缺点；4.4.基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可能诱导体基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可能诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。

内免疫应答，致使反复治疗效果下降 基因治疗三、基因转移的靶细胞三、基因转移的靶细胞靶细胞的选择须考虑：靶细胞的选择须考虑：1.￿容易取出和移植血液系统的细胞、成纤维容易取出和移植血液系统的细胞、成纤维细胞、成肌细胞；细胞、成肌细胞；2.￿细胞具有较长的寿命细胞具有较长的寿命3.￿离体细胞较易受外源基因转化离体细胞较易受外源基因转化4.￿离体细胞经转染和一定时间培养后再植回体离体细胞经转染和一定时间培养后再植回体内，仍较易成活内，仍较易成活体细胞体细胞生殖细胞生殖细胞基因治疗目前常用的靶细胞有：目前常用的靶细胞有：1.￿造血细胞造血细胞2.￿皮肤成纤维细胞皮肤成纤维细胞3.￿肝细胞肝细胞4.￿血管内皮细胞血管内皮细胞5.￿淋巴细胞淋巴细胞6.￿肌肉细胞肌肉细胞7.￿肿瘤细胞肿瘤细胞基因治疗三、基因干预三、基因干预￿Gene Interference主要干扰特定细胞的主要干扰特定细胞的mRNAmRNA转录和翻译转录和翻译基因治疗基因干预的种类：基因干预的种类：n1.1.反义反义RNA (antisense RNA)n2. 干扰干扰RNA (RNA interference)n3. 核酶核酶 (ribozyme)n4. 三链三链DNA技术技术基因治疗 （一）反义（一）反义RNA 1. 反义RNA与基因表达调控 利用反义RNA对体外培养的细胞进行基因表达调控，通常采用的方法有两种： （1）体外合成反义RNA，直接作用于培养细胞，细胞吸收RNA后，发挥作用。

缺点：RNA易降解 （2）构建能转录反义RNA的重组质粒，将质粒转入细胞，转录出反义RNA而发挥作用缺点：细胞内转录的反义RNA量不易控制基因治疗 反义反义RNA的关键技术问题：的关键技术问题：☻专专一一性性转转移移问问题题：：如如何何解解决决某某一一组组织织、、器器官官或系统中部分细胞病变进行专一性转移治疗或系统中部分细胞病变进行专一性转移治疗☻反义反义RNA进入靶细胞前的降解问题进入靶细胞前的降解问题 基因治疗2.受体介导反义受体介导反义RNA转移技术转移技术 ①①受体介导的受体介导的RNA转移十分专一，而且效率高；转移十分专一，而且效率高；②②被转移的被转移的RNA是被保护的，与周围环境之间存在是被保护的，与周围环境之间存在多聚赖氨酸的保护层多聚赖氨酸的保护层, 可以抵抗环境中的核酸酶可以抵抗环境中的核酸酶的降解作用的降解作用 将将脱脱唾唾液液酸酸血血清清类类粘粘蛋蛋白白（（ASGPASGP））与与多多聚聚赖赖氨氨酸酸（（PLPL））共共价价连连接接，，得得到到ASGP-PLASGP-PL复复合合物物，，成成为为运运载载核核酸酸的的工工具具。

ASGP-PLASGP-PL反反义义RNARNA复复合合物物可可以以专专一一性性地地被被肝肝细细胞胞表表面面的的ASGPASGP受受体体所所识识别别，，并并吞吞噬噬到到肝肝细细胞胞中中，，反反义义RNARNA进进入入肝肝细胞后，可被逐渐释放出来发挥作用细胞后，可被逐渐释放出来发挥作用 借借助助受受体体介介导导DNA转转移移方方法法把把DNA换换成成反反义义RNA，就可以实现受体介导的反义，就可以实现受体介导的反义RNA的转移基因治疗 3. 3. 反义反义RNA的应用前景的应用前景 受体介导的反义受体介导的反义RNARNA基因治疗有其自身的优点，而在基因治疗有其自身的优点，而在一定程度上补充了转基因治疗的不足一定程度上补充了转基因治疗的不足 （（l l）安全性高）安全性高 （（2 2）反义）反义RNARNA设计设计 和制备方便和制备方便 （（3 3）具有剂量调节效应）具有剂量调节效应 （（4 4）能直接作用于一些）能直接作用于一些RNARNA病毒病毒 反反义义RNA只只作作用用于于特特异异的的mRNA分分子子，，不不改改变变所所调调节节基基因因的的结结构构。

反反义义RNA分分子子无无论论怎怎样样修修饰饰，，最最终终将将在在细细胞胞内部被降解，不留内部被降解，不留“残渣残渣” 在在治治疗疗RNA病病毒毒感感染染性性疾疾病病时时，，受受体体介介导导的的反反义义RNA基基因因治治疗疗比比一一般般的的DNA基基因因治治疗疗有有更更大大的的优优势势利利用用反反义义RNA可以直接作用于病毒可以直接作用于病毒RNA，阻断，阻断RNA病毒的繁殖病毒的繁殖基因治疗（二）（二）RNA干扰干扰 1.RNA干扰现象干扰现象 RNA干扰（干扰（RNA interference，， RNAi）是一种由双）是一种由双链链RNA诱发的基因沉默现象在此过程中，与双链诱发的基因沉默现象在此过程中，与双链RNA有有同源序列的信使同源序列的信使RNA（（mRNA）被降解，从而抑制该基因）被降解，从而抑制该基因的表达基因治疗 2.RNA干扰的机制干扰的机制 RNA干扰过程主要有干扰过程主要有2个步骤：个步骤： （（1）小干扰性）小干扰性RNA（（siRNA））（（2））siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为体，称为RNA诱导的沉默复合体（诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex, RISC)。

该复合体可识别与siRNA有同源序列的mRNA，并在特异的位点将该mRNA切断 长双链RNA被细胞内的双链RNA特异性核酸酶Dicer切成21-23个碱基对的短双链RNA，称为小干扰性RNA（small interfering RNA，siRNA）基因治疗A. 贾第鞭毛虫Dicer的晶体结构； RNA干扰机制示意图 基因治疗3.RNA干扰的应用前景干扰的应用前景 RNA干扰研究目前已经在功能基因组学研究、微生物学研究、基因治疗和信号转导等广泛领域取得了令人瞩目的进展，使其在医学、生物学领域的应用有着广阔的前景基因治疗（三）核酶（三）核酶(ribozyme)用于基因治疗 天然核酶多为单一的天然核酶多为单一的RNARNA分子，具有自我剪切作分子，具有自我剪切作 用但核酶也可以由两个用但核酶也可以由两个RNARNA分子组成分子组成 在基因治疗时，利用核酶分子结合到靶在基因治疗时，利用核酶分子结合到靶RNARNA分子中分子中适当的邻位，形成锤头核酶结构，将靶适当的邻位，形成锤头核酶结构，将靶RNARNA分子切断，分子切断，通过破坏靶通过破坏靶RNARNA分子达到治疗疾病（如清除病毒基因组分子达到治疗疾病（如清除病毒基因组RNARNA）的目的。

的目的 只要两个只要两个RNARNA分子通过互补序列相结合，形成锤头分子通过互补序列相结合，形成锤头状的二级结构（状的二级结构（3 3个螺旋区），并能组成核酶的核心序个螺旋区），并能组成核酶的核心序列（列（1313个或个或1111个保守核苷酸序列），就可在锤头右上方个保守核苷酸序列），就可在锤头右上方产生剪切反应产生剪切反应基因治疗锤头型核酶的二级结构 和空间立体结构示意图三个双螺旋区13个核苷酸残基保守序列剪切反应在右上方GUX序列的3‘端自动发生（（N代表任意核苷酸，代表任意核苷酸，H代表代表A,U或或C））基因治疗 1. 核酶的设计核酶的设计 核核酶酶是是通通过过靶靶RNARNA分分子子与与核核酶酶分分子子共共同同组组成成酶酶活活性性结结构构域域，，要从靶分子和核酶分子两个方面来设计核酶要从靶分子和核酶分子两个方面来设计核酶 （1 1））选选择择合合适适的的靶靶部部位位，，该该部部位位具具有有核核酶酶切切割割位位点点，，能能与核酶分子结合并组成酶活性结构域与核酶分子结合并组成酶活性结构域。

（2 2））核核酶酶的的基基本本组组成成：：用用于于基基因因治治疗疗的的核核酶酶分分子子由由三三个个部部分分组组成成，，中中间间是是保保守守序序列列（（能能够够组组成成酶酶活活性性结结构构域），两端是引导序列域），两端是引导序列 在基因治疗中，主要是根据治疗的靶基因序列的在基因治疗中，主要是根据治疗的靶基因序列的特点，设计和合成特定的核酶设计的基本原则是特点，设计和合成特定的核酶设计的基本原则是核酶分子与靶部位结合后能形成酶活性结构域核酶分子与靶部位结合后能形成酶活性结构域 基因治疗核酶的作用机制 基因治疗 2.2.核酶的应用核酶的应用 与一般的反义与一般的反义RNA相比，核酶具有较稳相比，核酶具有较稳定的空间结构，不易受到定的空间结构，不易受到RNA酶的攻击更酶的攻击更重要的是，核酶在切断重要的是，核酶在切断mRNA后，又可从杂后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其它的交链上解脱下来，重新结合和切割其它的mRNA分子 基因治疗核酶导入细胞方法核酶导入细胞方法1、外源导入法：可以通过化学合成；也可以采用体外转录方法2、内源导入法：利用表达载体在细胞内转录产生核酶分子。

基因治疗（四）三链（四）三链DNA￿￿三链三链DNA在基因治疗中的意义在基因治疗中的意义 寡聚脱氧核苷酸（寡聚脱氧核苷酸（ODN）以）以DNA双螺旋分子的双螺旋分子的专一性序列为靶子，通过与该序列形成三螺旋专一性序列为靶子，通过与该序列形成三螺旋DNA来阻止转录来阻止转录 技术关键技术关键 TFO 的设计与合成的设计与合成专一性专一性 稳定性稳定性摄取与分布摄取与分布基因治疗基因治疗四、治疗基因的受控表达四、治疗基因的受控表达￿Regulated Expression of Therapeutic Gene基因治疗 时间时间: : 治治疗疗基基因因的的受受控控表表达达包包括括控控制制治治疗疗基基因因表表达的达的时间、空间和水平时间、空间和水平三个方面三个方面 空间空间: :表达水平：表达水平：希望治疗基因能在一个适当的水平表达希望治疗基因能在一个适当的水平表达 1.1.控控制制治治疗疗的的基基因因在在患患者者需需要要实实施施治治疗疗时时才才表表达达，，而平时不需要进行治疗时则处于关闭状态；而平时不需要进行治疗时则处于关闭状态； 2.2.根根据据不不同同疾疾病病的的治治疗疗要要求求，，控控制制治治疗疗基基因因持持续续表达的时间跨度。

表达的时间跨度 是是指指为为了了提提高高基基因因治治疗疗的的专专一一性性和和安安全全性性，，严严格格限限制制治治疗疗基基因因只只在在靶靶细细胞胞中中表表达达，，避避免免治治疗疗基基因因指指导导合合成成的的蛋蛋白白质质干干扰扰非非靶靶细细胞胞的的正正常常生生活活，，产产生生毒毒副副作用 基因治疗 要要实实现现治治疗疗基基因因的的受受控控表表达达，，必必须须建建立立完完善善的的基基因因表表达达调调控控体体系系基基因因调调控控策策略略大大致致有有以以下下几几种种：：基基因因内内部部调调节节机机制制、、基基因因外外部部调调节节机机制制、、利利用用病病灶灶微微环环境境使使治治疗疗基基因因特特异异性表达以及治疗基因的诱导表达性表达以及治疗基因的诱导表达等基因治疗☻使用正常细胞的组织特异性启动子、增强子元件使用正常细胞的组织特异性启动子、增强子元件☻使用病变细胞的组织特异性启动子、增强子元件使用病变细胞的组织特异性启动子、增强子元件（一）基因内部的调节机制（一）基因内部的调节机制基因治疗 1.1.使用正常细胞的组织特异性启动子、增强子元件使用正常细胞的组织特异性启动子、增强子元件 例例如如，，酪酪氨氨酸酸酶酶是是皮皮肤肤细细胞胞和和黑黑色色素素瘤瘤细细胞胞产产生生色色素素途途径径中中的的一一种种酶酶，，可可利利用用其其启启动动子子驱驱动动治治疗疗基基因因只只在在黑黑色色素素瘤细胞中表达，而不在正常的周边细胞中表达。

瘤细胞中表达，而不在正常的周边细胞中表达 不不同同类类型型的的正正常常细细胞胞或或组组织织中中往往往往存存在在某某些些特特有有的的蛋蛋白白质质，，它它们们的的基基因因表表达达调调控控元元件件可可用用于于驱驱动动治治疗疗基基因因的特异性表达，从而起到治疗作用的特异性表达，从而起到治疗作用基因治疗 2.2.使用病变细胞的组织特异性启动子、增强子元件使用病变细胞的组织特异性启动子、增强子元件 某某些些病病变变的的细细胞胞或或组组织织产产生生一一些些特特殊殊的的蛋蛋白白质质，，其其基基因表达调节元件也可以用来控制治疗基因的特异性表达因表达调节元件也可以用来控制治疗基因的特异性表达 甲甲胎胎蛋蛋白白(AFP)(AFP)基基因因正正常常情情况况下下只只在在胚胚胎胎肝肝细细胞胞中中表表达达，，不不在在成成年年肝肝脏脏细细胞胞中中表表达达肝肝细细胞胞腺腺癌癌细细胞胞中中AFPAFP基基因因异异常常激激活活，，因因此此可可利利用用该该基基因因启启动动子子驱驱动动治治疗疗基基因因( (如如自自杀杀基基因因) )在癌细胞中表达，使癌细胞经给药后被杀死。

在癌细胞中表达，使癌细胞经给药后被杀死 癌癌胚胚抗抗原原(CEA)(CEA)是是膜膜糖糖蛋蛋白白家家族族的的成成员员，，在在许许多多腺腺癌癌细细胞胞中中表表达达很很高高，，采采用用其其启启动动子子可可以以使使治治疗疗基基因因只只在在CEACEA阳阳性性的癌细胞中表达，而不会在阴性细胞中表达的癌细胞中表达，而不会在阴性细胞中表达基因治疗（二）基因外部的调节机制（二）基因外部的调节机制 除利用基因内部的调节机制以外，还可通过施加外部刺除利用基因内部的调节机制以外，还可通过施加外部刺激，促进治疗基因在特定细胞或组织中表达激，促进治疗基因在特定细胞或组织中表达 采用热休克蛋白基因的表达调控元件来启动治疗基因，采用热休克蛋白基因的表达调控元件来启动治疗基因，可以通过对病灶局部进行热处理，达到使治疗基因特异性可以通过对病灶局部进行热处理，达到使治疗基因特异性表达的目的表达的目的基因治疗（三）利用病灶微环境使治疗基因特异性表达（三）利用病灶微环境使治疗基因特异性表达 病灶微环境与正常时往往不同，因此可利用这些变化病灶微环境与正常时往往不同，因此可利用这些变化控制治疗基因的表达。

控制治疗基因的表达 例如，例如，在肿瘤病灶处在肿瘤病灶处，常常出现葡萄糖缺乏等情况，，常常出现葡萄糖缺乏等情况，葡萄糖调节蛋白葡萄糖调节蛋白GRP78/BipGRP78/Bip的含量也随之增加，使癌细胞的含量也随之增加，使癌细胞能够抵御应激当采用这种基因的启动子来控制治疗基因能够抵御应激当采用这种基因的启动子来控制治疗基因时，可以使治疗基因在肿瘤细胞中表达，使肿瘤组织坏死时，可以使治疗基因在肿瘤细胞中表达，使肿瘤组织坏死 基因治疗 肿瘤细胞生长速度快于形成血管的内皮细胞，造成供肿瘤细胞生长速度快于形成血管的内皮细胞，造成供血不足，因此在肿瘤内部形成酸性、缺氧和营养缺乏的区血不足，因此在肿瘤内部形成酸性、缺氧和营养缺乏的区域缺氧条件可以通过缺氧诱导因子域缺氧条件可以通过缺氧诱导因子(HIF-1)(HIF-1)和缺氧响应和缺氧响应元件元件(HRE)(HRE)相互作用，调节一些基因的表达；如果采用缺相互作用，调节一些基因的表达；如果采用缺氧响应元件氧响应元件(HRE)(HRE)来控制治疗基因的表达，即可实现治疗来控制治疗基因的表达，即可实现治疗基因只在缺氧的肿瘤组织中表达，而在正常组织中不表达。

基因只在缺氧的肿瘤组织中表达，而在正常组织中不表达 （三）利用病灶微环境使治疗基因特异性表（三）利用病灶微环境使治疗基因特异性表达达 基因治疗（四）治疗基因的诱导表达（四）治疗基因的诱导表达 采用组织特异性启动子控制治疗基因的表达，可能采用组织特异性启动子控制治疗基因的表达，可能造成这些基因在靶细胞中表达，不再受外界控制为了造成这些基因在靶细胞中表达，不再受外界控制为了避免这种情况发生，研究人员正在开发和完善一些避免这种情况发生，研究人员正在开发和完善一些可诱可诱导性基因表达系统导性基因表达系统 这种系统的必要成分：一种是转录激活剂，它只在诱这种系统的必要成分：一种是转录激活剂，它只在诱导药物存在时才能与导药物存在时才能与DNADNA结合；另一种则是特异性基因表结合；另一种则是特异性基因表达调控元件，仅对这种转录激活剂有所响应达调控元件，仅对这种转录激活剂有所响应 基因治疗四环素抗性操纵子系统四环素抗性操纵子系统原理原理n四环素抗性基因的转录受四环素抗性基因的转录受TetTet阻遏蛋白的负调控阻遏蛋白的负调控n无四环素存在时，阻遏蛋白与四环素抗性操纵子序列无四环素存在时，阻遏蛋白与四环素抗性操纵子序列结合阻断四环素抗性基因的表达；结合阻断四环素抗性基因的表达；n四环素存在时，阻遏蛋白与四环素具有极高的亲和性，四环素存在时，阻遏蛋白与四环素具有极高的亲和性，造成阻遏蛋白对四环素抗性操纵子阻遏解除，使四环造成阻遏蛋白对四环素抗性操纵子阻遏解除，使四环素抗性基因的转录得以进行。

素抗性基因的转录得以进行 基因治疗五、基因治疗的应用研究五、基因治疗的应用研究The Application of Gene Therapy基因治疗腺苷脱氨酶腺苷脱氨酶(ADA)缺乏的严重联合免疫缺缺乏的严重联合免疫缺陷陷(SCID)n病因:n淋巴细胞缺乏ADA酶￿￿￿￿￿腺苷、dATP堆积￿￿￿￿￿￿破坏免疫功能￿￿￿￿患儿很少活到成年n第一个基因临床治疗的方案(1990.9.14,NIH)n治疗策略：n淋巴细胞ADA酶 恢复至正常水平的 5%-10%￿￿￿￿维持免疫系统功能 改善病人症状基因治疗治疗基本步骤:ADA基因+逆转录病毒载体导入患者淋巴细胞体外扩增回输病人体内淋巴细胞ADA酶恢复至正常水平的5%-10% 维持免疫系统功能,改善病人症状基因治疗（一）遗传病的基因治疗研究（一）遗传病的基因治疗研究 1.在在DNA水平明确其发病原因及机制；水平明确其发病原因及机制；2.必须是单基因遗传病，而且属隐性遗传；必须是单基因遗传病，而且属隐性遗传；3.该基因的表达不需要精确调控；该基因的表达不需要精确调控；4.该该基基因因能能在在一一种种便便于于临临床床操操作作的的组组织织细细胞胞(如如皮皮肤肤细细胞胞，，骨髓细胞等骨髓细胞等)中表达并发挥其生理作用；中表达并发挥其生理作用；5.该该遗遗传传病病不不经经治治疗疗将将有有严严重重后后果果(如如不不治治疗疗难难以以存存活活等等)。

可可供供选选择择并并符符合合上上述述4条条以以上上要要求求的的不不过过只只有有30余余种种遗遗传传病遗传病基因治疗必须符合以下要求：遗传病基因治疗必须符合以下要求：基因治疗1 1．腺苷脱氨酶．腺苷脱氨酶(ADA)(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶 (PNP)(PNP)缺乏症缺乏症 2 2．珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病．珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病 3 3．血友病和其他血浆蛋白缺乏症．血友病和其他血浆蛋白缺乏症 4 4．苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢缺陷病．苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢缺陷病 5 5．莱．莱- -纳纳(Lesch-Nyhan)(Lesch-Nyhan)综合征综合征 6 6．家族性高胆固醇血症．家族性高胆固醇血症 7 7．囊性纤维化病．囊性纤维化病 基因治疗（二）恶性肿瘤基因治疗研究（二）恶性肿瘤基因治疗研究 （（1 1）通过基因置换和基因补充，导入多种抑癌基因以抑）通过基因置换和基因补充，导入多种抑癌基因以抑制癌症的发生、发展和转移；制癌症的发生、发展和转移； 肿瘤发生是一个极为复杂的过程，许多基因的突变肿瘤发生是一个极为复杂的过程，许多基因的突变会导致肿瘤的发生。

会导致肿瘤的发生2 2）抑制癌基因的活性，通过干扰癌基因的转录和翻译，）抑制癌基因的活性，通过干扰癌基因的转录和翻译，发挥抑癌作用；发挥抑癌作用；（（3 3）增强肿瘤细胞的免疫原性，通过对肿瘤组织进行细）增强肿瘤细胞的免疫原性，通过对肿瘤组织进行细胞因子修饰，刺激免疫系统产生对肿瘤细胞的溶解和胞因子修饰，刺激免疫系统产生对肿瘤细胞的溶解和排斥反应；排斥反应；（（4 4）通过导入）通过导入“自杀基因自杀基因”杀伤癌细胞杀伤癌细胞基因治疗 1 1．调节机体免疫应答：．调节机体免疫应答： （（1 1））将将细细胞胞因因子子( (如如干干扰扰素素、、白白细细胞胞介介素素等等) )的的基基因因，，导导入入机机体体免免疫疫细细胞胞，，激激活活免免疫疫细细胞胞并并促促进进其其增增殖殖分分化化，，增增强强机机体体的的细细胞胞和和体体液液免免疫疫应应答答，，促促进进机机体体清清除除病病毒毒感感染细胞和游离病毒染细胞和游离病毒 （（2 2）将能够诱导机体产生保护性免疫应答的病毒抗）将能够诱导机体产生保护性免疫应答的病毒抗原基因，如乙型肝炎病毒表面抗原基因等，导入机体，原基因，如乙型肝炎病毒表面抗原基因等，导入机体，表达的抗原不仅可以诱导机体产生保护性抗体，还可以表达的抗原不仅可以诱导机体产生保护性抗体，还可以引发特异性的细胞免疫应答，产生对野生致病病毒攻击引发特异性的细胞免疫应答，产生对野生致病病毒攻击的防御作用。

的防御作用三）病毒性疾病的基因治疗研究（三）病毒性疾病的基因治疗研究基因治疗2 2．．抗抗病病毒毒复复制制：：根根据据病病毒毒在在机机体体细细胞胞中中复复制制周周期期的各个环节来设计的，主要包括：的各个环节来设计的，主要包括： （（1））抑抑制制病病毒毒与与宿宿主主细细胞胞结结合合：：即即阻阻断断病病毒毒表表面面抗抗原原决定簇与宿主细胞受体间的特异性结合决定簇与宿主细胞受体间的特异性结合2）干扰病毒基因组的转录起始和调控干扰病毒基因组的转录起始和调控3）抑制病毒基因组的复制和蛋白质合成抑制病毒基因组的复制和蛋白质合成4））RNA干扰技术干扰技术5））将将抗抗病病毒毒蛋蛋白白质质基基因因，，如如2ˊ→5ˊ腺腺苷苷酸酸合合成成酶酶等等基基 因因，，导导入入机机体体细细胞胞并并持持续续表表达达，，可可以以激激活活核核酸酸酶酶F，，降降解解病病毒毒RNA，，对对RNA病病毒毒的的感感染染产产生生明明显显的的抵抗作用抵抗作用 基因治疗￿￿￿￿￿￿￿1 1、难以获得真正有治疗作用的基因难以获得真正有治疗作用的基因。

2 2、外源基因的表达难以在体内精确调控外源基因的表达难以在体内精确调控 3 3、体细胞经体外培养后，其生物学特性会有改变体细胞经体外培养后，其生物学特性会有改变 4 4、过多的外源蛋白对机体带来可能的影响过多的外源蛋白对机体带来可能的影响 5 5、随机整合潜在的威胁随机整合潜在的威胁 （二）基因治疗有待解决的问题（二）基因治疗有待解决的问题基因治疗基因治疗。