红鳍东方鲀的MAPK信号通路分析.docx

红鳍东方鲀的MAPK信号通路分析 王冠 胡子文 周金旭 王盛南 李鑫 仇雪梅 王秀利摘 要：为研究红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）不同生长阶段生长发育差异的分子机制，基于13与15月龄红鳍东方鲀的脑与肌肉组织转录组数据，以及在两时期间KEGG通路分析中差异显著的MAPK信号通路，结合基因互作分析对这期间发生的生物过程进行生物信息学方面的关联预测结果表明：MAPK信号通路通过调节fos和jun及其下游基因，促进这期间肌肉和骨骼发育，使红鳍东方鲀在两时期间生长而fos和jun在两组织均上调，但在脑中抑制fos和jun的基因上调程度更高，而在肌肉中则较低MAPK信号通路介导的egr1、c/ebpβ、ctgf等基因与骨骼发育相关，在此期间可能伴随着红鳍东方鲀骨骼的生长MAPK信号通路还调节tgf-β、ctgf、pai1等与组织纤维化相关的基因，在转录层面上纤维化过程在肌肉中持续而在脑中减弱，可能促进了肌肉与骨骼的发育MAPK信号通路还可能影响脂质代谢，即脑中γ-氨基丁酸相关基因下调有促进脂肪积累的作用，该过程伴随着基础代谢降低肌肉中核受体亚家族D组（nr1d）基因的下调促进了脂质吸收，mstn b基因可能调节了这个过程。

关键词：红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）;组织差异基因;MAPK信号通路;生物信息分析红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）是国内北方重要的海水养殖鱼类，是出口创汇的主要海珍品[1]但由于在北方养殖的红鳍东方鲀商品鱼不能当年育成[2]，养殖需经历三个阶段，幼鱼鱼苗在5—6月份至10—11月份时期;11月份至翌年4月份时期;翌年4月份至10—11月份的养成期而在养成期的4—6月，虽水温回升，鱼体活跃，但生长依然缓慢由于红鳍东方鲀在脊椎动物中基因组较小，较易于分析其基因间的关系，因此红鳍东方鲀为脊椎动物模式物种之一[3]因而研究红鳍东方鲀在缓慢生长时期的分子变化，不仅可以了解到这一时期的生命活动，探求缩短缓慢生长时期，节约养殖成本增加收益的方法，同时可以为应用于其它物种提供一定的参考脑部存在大量神经网络，可控制垂体等内分泌器官调节激素分泌，进而影响个体的生长代谢而肌肉则是可以直接反映生长性状的组织，有多数生长相关激素受体存在因此通过比较研究这两个与生长性状密切相关组织的基因表达差异及对应的信号通路之间的关联，有助于了解影响生长性状的生理过程及其涉及到的生化反应信号通路是指能将细胞外的分子信号经细胞膜传入细胞内发挥效应的一系列酶促反应通路。

这些细胞外的分子信号（即配体）可与位于细胞表面或细胞内部的受体结合，引起受体的构象变化，从而实现信号的进一步传递每个细胞对特定的细胞外信号分子做出不同反应，使它们得以共同完成生命活动而丝裂原活化蛋白激酶（MAPK，Mitogen-activated protein kinase）信号通路，是一种重要的信号通路，可由多种信号激活酪氨酸激酶受体，在激酶级联反应后引发转录和翻译，进而发生细胞增殖、分化和迁移因此在MAPK信号通路上脑与肌肉两组织的差异可反应这期间发生的生命活动本研究基于脑、肌肉转录组的差异基因通过MAPK信号通路以及差异基因互作，分析红鳍东方鲀在缓慢生长的期间两个组织在关键的表达及信号通路上的差异，以期发现这个过程中影响红鳍东方鲀生长的分子变化及生物过程，为红鳍东方鲀发育过程及生产实践应用提供基础数据1 材料及方法1.1 数据获取本研究是基于本实验室的红鳍东方鲀脑和肌肉的转录组数据[4]进行的后续分析转录组数据来自健康的（13月龄与15月龄）实验鱼的脑与肌肉组织，并使用RNA-Seq基因组比对软件HISAT2 v2.0.5将过滤后的序列读长（reads）与红鳍东方鲀参照基因组（FUGU 5）进行比对（mapping）后使用StringTie v1.3.3b软件进行组装。

并以|log2（FoldChange）| > 1 &padj< 0.05为标准筛选差异基因，log2（FoldChange）>1为上调，反之为下调通过超几何分布原理进行富集分析，在富集分析中发现KEGG（京都基因与基因组百科全书，Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路中MAPK信號通路具有显著性（padj<0.05），且与生长相关，富集分析图见王盛南等[4]因而本文基于该通路对红鳍东方鲀该阶段生长的生物学过程进行预测1.2 性状测量分别测量13月龄与15月龄红鳍东方鲀各30尾样品的体重、体长和体全长，使用SPSS19进行单因素方差分析，分析这两时期这些性状的差异性1.3 差异基因筛选在前期工作的基础上[4]，将差异基因进一步汇总分析比较两组织之间随时间变化的差异基因可找到包括只在脑或肌肉表达的差异基因，两组织中随时间表达趋势相同的差异基因，以及两组织随时间表达趋势相反的差异基因等几类，这些差异基因的筛选有助于判断脑与肌肉这两组织中，代谢过程中的相同及差异1.4 差异基因互作分析以上述两组织之间随时间变化的差异基因为分析对象，使用STRING 11.0（https：//string-db.org/）分析基因产物之间的互作，构建蛋白质关联网络，设置最低互作置信值为 0.400，并使用k-means聚类的方法对差异基因对应的蛋白产物进行蛋白质关联性分析。

2 结果与分析2.1 两时期性状分析性状测量结果显示，13月龄红鳍东方鲀平均体重（0.460.07）kg，平均体长为（23.681.27）cm，平均体全长为（28.371.55）cm;而15月龄平均体重（0.530.07）kg，平均体长为（25.331.00）cm，平均体全长为（29.981.24）cm这些性状15月龄较13月龄差异均极显著，P<0.01体重、体长和体全长分别平均增长14.93%、6.97%及5.70%2.2 MAPK信号通路KEGG通路分析中，15月龄相对13月龄的脑组织MAPK信号通路是与生长相关的显著性最高的信号通路，通路图如图1A（封二）所示，富集到的差异基因也是具显著性的通路中最多的，有24个差异基因[4]其中上调基因有20个，因而脑组织MAPK信号通路显著性主要是由上调基因引起，而下调的基因很少，只有4个且由通路图可知，与增殖分化相关的基因上调且包括nr4a1（对应图1A中Nur77，产物为神经生长因子IB，NGFIB）以及属于激活蛋白1（Activator protein 1，AP-1）家族的fos（封二图1A中c-fos）、jun（封二图1A中c-JUN）及jund。

而抑制fos上游基因ERK（细胞外调节蛋白激酶）的MKP（MAPK磷酸酶，又称DUSP）的基因也上调，且上调程度较fos更高，对应的差异基因包括dusp1、dusp2、dusp6，这些基因全部是上调基因而dusp2的产物也有抑制JNK（c-Jun N-末端激酶）的功能JNK的基因作为jun与jund的上游基因也被上调程度更大的HSP72（热激蛋白72）相关基因抑制而在15月龄相对13月龄的肌肉组织中MAPK通路见图1B（封二），有15个差异基因，因其差异基因占该通路表达的基因较少，使得该通路差异不显著在差异基因中上调基因有12个，下调基因只有3个而fos、jun及jund这三个与增殖分化相关的基因也在肌肉中上调，相较于脑中不同的是，在上游抑制它们的图1B（封二）中MKP与HSP72中的基因上调程度较小，上调的基因也少，并且图1B（封二）中MKP的dusp10随时间下调，这些因素可能是肌肉中fos上调程度较大的原因而红鳍东方鲀在两时期间体重、体长和体全长性状显著增加，这些性状的改变伴随着肌肉量的增加因而，有增殖分化相关作用的fos、jun等上调基因，可能是这两时期间影响肌肉组织生长，进而引起这期间的性状差异的重要基因。

2.3 两组织间的关键差异基因分析研究结果发现两组织间只在脑组织表达的差异基因有86个，其中有75个随时间下调，其余随时间上调在两月龄时期间相较于脑，仅在肌肉中有差异表达的基因则只有3个，其中有1个随时间上调，为组蛋白甲基转移酶1（SET and MYND domain containing 1，smyd1），研究发现该基因有心肌和骨骼肌的组织特异性[5]，在对小鼠[6]和斑马鱼[7]的研究中发现，smyd1是调节心肌和骨骼肌发育的关键因子，但未发现其对应的KEGG通路;另2个下调，其中一个是新发现的基因，该基因没有与现有数据库匹配的注释，其功能未知，另一个为蛋白磷酸酶1调节亚基3A（Protein phosphatase 1 regulatory subunit 3A，ppp1r3a）随时间变化，在两组织同时上调表达的差异基因有22个基因，而同时下调基因有4个此外，还有3个基因在脑中下调，而在肌肉中上调，分别是肌生長抑制素b（Myostatin b，mstnb）、radical S-adenosyl methionine domain containing 2（rsad2）和甘油3-磷酸脱氢酶（Glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1，gpd1）。

2.4 差异基因互作分析结果针对上述脑、肌肉两组织在两时期不同关联的基因，可找到包括在脑中随时间下调而在肌肉中不表达的基因，脑中随时间上调而在肌肉中不表达的基因，肌肉组织中有差异而在脑中不表达的基因，两组织中随时间表达趋势相同的差异基因，以及两组织随时间表达趋势相反的差异基因，将这五类进行互作分析及聚类我们发现两时期在脑组织下调表达而在肌肉中不表达差异基因有60个，并出现了两个与功能相关的聚类，见图2（封三），分别与光转导（图中示蓝色）和γ-氨基丁酸相关（图中示绿色），见图2（封三）;而在两组织中随时间表达趋势相同的差异基因有23个被识别，是与AP-1相关的一个聚类，见图3（封三），而其他的分类中没有发现基因产物间的互作3 讨论3.1 MAPK信号通路在两组织之间的差异基于脑与肌肉两组织MAPK信号通路图中可以发现，与增殖分化相关的基因包括fos、jun及jund在两组织均上调表达，而肌肉中有抑制这些基因功能的MKP与HSP72的相关基因上调程度较小，对应差异基因也少其中MKP对MAPK起负调控作用[8]，而肌肉中dusp10随时间下调，降低了对ERK及JNK的抑制，可促进fos、jun的表达。

而HSP72作为一种热激蛋白，可以促进DNA修复，并在细胞凋亡、生长和分化过程中发挥功能[9]通路中两组织差异最大的是gadd45，有4个属于该类的基因在脑中上调表达，而在肌肉中则并无显著性而gadd45功能与生长停滞和刺激DNA修复有关[10]，并可能是脑中taok3基因（TAO基因集内）下调表达的原因（封二图1A），TAOK3是一种MAPKKK（丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶又称MAP3K），被证明是成骨细胞JNK途径上游的激活剂，有关人和小鼠的实验证明，taok3缺乏使JNK途径的活化有缺陷，并伴随骨质减少[11] 此外，图1a中Nur77对应基因也在脑中上调，其可被生理和物理刺激来诱导[12]，在小鼠T细胞的研究中发现，Nur77可以抑制AP-1功能进而抑制其下游基因的表达[13]脑中GF（生长因子）基因集上调表达，上调基因为血管生成素-2a（angpt2a）而RTK（受体酪氨酸激酶）中的基因LOC101073085、LOC101064806在脑中上调，原肌球蛋白受体激酶B（ntrk2b）下调蛋白磷酸酶1（ppm1）属于PP2CA（封二图1A），在脑中下调，有负调节MAPKK（丝裂原活化蛋白激酶激酶又称MAP2K）的活性并抑制JNK激酶级联反应的激活的作用。

而在肌肉中上调表达且差异倍数较大而脑中无差异的基因有crkl。