分子生物学：第四章-转录后加工.ppt

第三章 RNA的转录RNA transcription 本章主要内容3.1 RNA的结构、分类和功能3.2 RNA转录3.3 转录后加工3.4 RNA 复制 （延伸讲解）3.3转录后加工一、 原核生物 mRNA 特征 原核生物 mRNA 的半衰期很短；转录和翻译偶联，发生在同一个空间，几乎同步进行，没有加工 许多原核生物 mRNA 为多顺反子的形式存在 原核生物 mRNA 的5端无帽子结构，3没有或只有较短的 Poly A 结构3.3.1 原核生物 RNA 的加工 原核生物多顺反子基因中，后续编码区翻译起始 受单个順反子之间距离的影响A.B.50S30S30S50SB的翻译效率高于A2个相距较近时，30S亚基仍然结合在mRNA上，仅50S亚基离开了，需再结合，所以B中的翻译效率高于A中多基因共转化时，中间连接序列不应太长原核生物mRNA的加工SD序列（Shine Dalgarno sequence） 核糖体结合序列，ribosome binding sequence, RBS (AGGAGGU，保守序列) 可被核糖体识别的位于 mRNA 前端 的一段序列 存在于原核生物，起始密码子 AUG 上游 7-12 个 nt 处 SD 与16S-rRNA 3端反向互补，在核糖体与 mRNA 结合过程中发挥作用噬菌体X174 mRNA 5端与16S rRNA 3端序列比较 X174基因 mRNA 序列 5 - 3DCCACUAAUAGGUAAGAAAUCAUGAGUECUGCGUUGAGGCUUGCGUUUAUGGUAJCGUGCGGAAGGAGUGAUGCAAUGUCCFCCCUUACUUGACGAUAAAUUAUGUCUGUUCUGCUUAGGAGUUUAAUCAUGUUUACAAAUCUUGGAGGCUUUUUUAUGGUUBAAAGGUCUAGGAGCUAAAGAAUGGAArRNA序列 5 - 3AUUCCUCCACCAG二、 原核生物 rRNA 加工 原核细胞三种 rRNA (16S, 23S, 5S rRNA) 和两种 tRNA, 是一个转录单元（这种共转录物在E.coli中共有7个），转录前体为 30S rRNA 中间产物 30S rRNA 中间产物含有反向重复序列，可形成 茎环 结构 糖核酸酶III 可以识别茎环结构中茎，进行剪切 前体经 剪切 释放出三种 rRNA 三种 rRNA 经核苷酸 修饰 （核糖 2-OH甲基化等）形成原核细胞 30S rRNA 前体加工成不同 RNA 分子切割位点原核生物rRNA的加工（RNA酶）甲基化修饰：（通常是A）甲基供体-S-腺苷甲硫氨酸剪切：（1）Rnase剪切释放出5S，16S，23S前体分子；（2）随后RNA酶M5,M16,M23分别在每一前体分子的5端和3端进行剪切。

三、原核生物 tRNA 加工 tRNA 约 80 nt, 3 端含 CCA； E. coli 约 60 个 tRNA 基因 剪切和修饰 剪切修饰的核酸酶 P，F，D；P 和 F 为内切核酸酶 P 为异源二聚体，含一个RNA和蛋白质分子，负责5切除，产生成熟的 5-端 F 的切点在 tRNA 的3端，作用后在 tRNA 的3端留下多余的三个核苷酸 D 为外切核酸酶，从3 至5方向切除，产生成熟3端 tRNA核苷酸修饰，碱基修饰，甲基化，脱氨，还原等，近100 种 Endonuclease, 内切核酸酶Exonuclease,外切核酸酶前体 Pre-tRNA大肠杆菌 tRNA 前体及加工后的 tRNA3.3.2 真核生物 mRNA 的特征真核生物mRNA 5端的“帽子”结构，戴帽多数真核生物mRNA 3端的多聚(A) 尾，加尾多数真核生物mRNA 有内含子真核生物 RNA 加工过程及其生理功能加工过程生 理 功 能戴 帽mRNA 从细胞核向细胞质运转，翻译起始加Poly A尾转录终止，翻译起始和 mRNA 降解RNA 剪接从 mRNA，tRNA 和 rRNA 分子中切除内含子RNA 切割从前体 RNA 中释放成熟 tRNA 和 rRNA 分子 真核生物 mRNA 结构模式非编码区长度不一AUG编码区几百-几千核苷酸UGAUAGUAA非编码区100-250 核苷酸5 m7GpppNmNm帽子3Poly A多腺苷酸尾一、5 端的“帽子”形成过程，cap除去一个磷酸2-羟基甲基化S-腺苷甲硫氨酸CH3鸟嘌呤的7-N位甲基化5-帽子的结构及类型Cap-0(1个甲基)m7GpppXpYp-(共有)Cap-1(2个甲基)m7GpppXmpYp-Cap-2(3个甲基)m7GpppXmpYmp- 5-帽子的功能 保护作用，不被核酸酶降解 RNase 酶不能降解mRNA 末端的三磷酸酯键， 可译性，提高蛋白合成 真核 mRNA 到达核糖体后，帽子结合蛋白识别帽子结构 及时转运，进入细胞质 帽子可促进成熟的 mRNA 从细胞核中转运出来，不被加帽的 hnRNA 留在细胞核内实验证明，不加帽的U1 snRNA 留在细胞核p特殊组分（CPSF）识别AAUAAAp剪切因子（CF）在加尾位点AAUAAA下游1130nt处剪切RNAp末端腺苷转移酶poly(A)聚合酶合成poly(A)尾巴pPBP与poly(A)结合，反应停止二、真核生物 mRNA 加尾多聚 mRNAAAUAAACAAAAAAAAAAAAAAPABPPABP, Poly(A)结合蛋白，聚合酶延伸的刺激因子mRNA前体53AAUAAACAGUPoly(A)信号Poly A合成酶AAUAAACAGUCstFCPSFCSF (cleavage stimulation factor)CPSF (cleavage and poly(A) specific factor) 第一步加短的寡聚A（10nt），依赖于AAUAAA序列，由poly（A）聚合酶在特殊因子指导下完成的 第二步是寡聚A尾巴延伸到240nt的长度，不需要AAUAAA序列，需要识别寡聚A并指导poly（A）聚合酶延伸的刺激因子PABP加尾特点p polyA尾巴独立于DNA模板p 在核内进行p 在剪接前进行p 原核生物mRNA3端无polyA尾巴结构Poly (A) 的功能 mRNA 的保护作用 防止 mRNA 被降解，携带Poly(A)的 mRNA寿命长 mRNA 的可译性 真核 mRNA 在翻译中的结合蛋白之一是 Poly（A）结合蛋白 I （PAB I），与此结合提高了 mRNA 翻译效率 可进行mRNA纯化，构建cDNA文库 存在极少数不含 Poly（A）尾的基因 组蛋白 mRNA 未检测到 Poly（A）尾三、 真核细胞 RNA 内含子 外显子, exon 在间隔基因及其初级转录产物上出现，并表达为 成熟RNA 的核酸序列 内含子, intron 转录后在剪接过程中被除去的核酸序列mRNA53poly AtailexonexonexonMaturemRNAProcessingTranscriptionSplicing35stop codonto cytoplasmremoving intron存在于多数真核生物mRNA中一些线粒体、叶绿体及某些低等真核生物的 rRNA 基因 存在于线粒体、叶绿体 mRNA 的前体中真核生物tRNA 基因1. RNA 中 的内含子AGCEFDBL123456753RNADNA鸡卵清蛋白成熟 mRNA 与带有该基因互补链 DNA 序列杂交示意图Pierre Chambon (France) (1977) ABCDEFGL1 23 46577700bp鸡卵清蛋白基因的结构：L 及 1-7 区表示外显子（exon）区A-G 为内含子（intron）区部分人类基因中内含子序列所占比重基因长度/kb内含子数目内含子所占比例/胰岛素1.4267-球蛋白1.4269血清蛋白181389胶原蛋白组分3111771因子1862595萎缩性肌强直因子24007899生物体内各种内含子的类型内含子类型细胞内定位GU-AG（主要）细胞核，pre-mRNA（真核）AU-AC（次要）细胞核，pre-mRNA（真核） 型内含子细胞核，pre-rRNA（真核），细胞器RNA，少数细菌RNA 型内含子细胞器，部分细菌RNA 型内含子细胞器双内含子细胞器pre-tRNA 中的内含子细胞核，pre-mRNA（真核）3. 内含子的生物学功能调控作用，提高基因表达效率真核生物基因工程载体的构件，RNAi 载体的茎环结构 选择性剪接内含子，外显子不按其线性顺序剪接，也有不被剪接的断裂基因发现不久，Crick（1978年）提出了一系列发人深思的问题：（1）剪切作用若是通过酶来进行的，那么这种剪接酶是怎样识别RNA上特定的位点？（2）剪切酶有没有特异性？对不同的RNA是否需要不同的酶？（3）切除的RNA是以线状还是环状存在的？切下的RNA的命运将如何？3.3.3 RNA 剪接 RNA splicing mechanismRNA剪切主要有3种： Pre-mRNA的剪切-由剪切体剪切 I类自剪切内含子 II类自剪切内含子一、 Pre-mRNA的剪切-由剪切体剪切利用 snRNP 与 hnRNA 结合成为剪接体Small nuclear ribonucleoprotein particle, snRNP mRNA 前体中常见的内含子剪接所必需的保守序列： 5 端GU，3 端AG（Chambon法则） 5 端保守的GUPuAGU 3端上游18-50个核苷酸处有一个序列PyNPyPuAPy，其中A100%保守，具有2-OH，称为分支点A/CAGGUPuAGU A Py-rich AGG外显子内含子外显子分支点5 剪接位点3 剪接位点 RNA序列决定了剪切的位置 snRNAs 真核细胞细胞核和细胞浆中都含有许多小RNA，约有100到300个碱基 每个细胞中可含有105-106个这种RNA分子 由RNA聚合酶或所合成的，其中某些像mRNA一样可被加帽 在细胞核中的小RNA称为snRNA，而在细胞浆中的称为scRNA 剪接体的形成snRNP 在天然状态下它们均与蛋白质相结合，故分别称为snRNP和scRNP 某些snRNPs和剪接作用有密切关系 有些snRNPs分别和供体及受体剪接位点以及分支顺序相互补 这些RNA因富含尿嘧啶而命名为U1、U2等 U1、U2、U4、U5和U6参与pre-mRNA剪接 有些参与pre-rRNA甲基化位点的识别剪接体中的snRNP 的功能snRNPsnRNA(nt)在拼接中可能的作用U1165通过序列互补，结合到5拼接位点上U2185结合到分枝位点(U2AF)，催化转酯反应,与U6配对U5/ U4/ U6116/145/106三聚体U5: 结合5与3拼接点外显子U4：拼接体的组装U6：结合5拼接点，与U2一起催化转酯反应 U1普遍存在于哺乳动物、鸟类和昆虫细胞中 其5端的11个核苷酸是单链的，并有一段和内含子左侧的供体序列互补 U2 与分支点序列互补U5snRNP，识别并结合于内含子3末端剪接位点U4，U6也参加到剪接体中，起配合作用mRNA与snRNP形成复合体-剪接体U4/6U5U1U2完整的剪接体前体 mRNA 剪接体的形成U1 - 5端保守区域U2 -分支点 (其中A为转酯攻击位点)U6 /U4- 5保守序列U5 与 5GU & 3AG配对，以连接外显子U6U2-稳定剪接复合体套环结构切除的套环结构 第一步转酯反应：由位于分支点的保守A的2-OH引发的，它作为亲核基团攻击内含子5剪切位点的鸟甘酸的磷酸二酯键，从上游切开 RNA 链，游离的5磷酸与分支点的保守A的2-OH连接 第二步转酯反应：5外显子作为亲核基团，攻击内含子3剪切位点核苷酸上的磷酸二酯键，使内含子完全切开两步转酯反应二、 I 类内含子的自我剪切1.I类内含子的结构特点：u其边界序列为5U-G3；u具有中部核心结构（Centralcorestructure）u内部引导顺序（internalguidesequenceIGS）2.自我剪。