大肠杆菌表达系统ppt课件.ppt

外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中的表达大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的优势 全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁衍迅速、培育简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA同意为平安的基因工程受体生物外源基因在大肠杆菌中的表达大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的优势 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数转录翻译P tac = 3 P trp = 11 P lac启动子启动子-35 -35 区序列区序列-10 -10 区序列区序列 P lac P lacT T T A C A T T T A C A T A T A A TT A T A A T P trp P trp T T G A C AT T G A C AT T A A C TT T A A C T P tac P tacT T G A C AT T G A C AT A T A A TT A T A A T P traA P traA T A G A C A T A G A C A T A A T G TT A A T G T P P l lL LT T G A C AT T G A C A G A T A C TG A T A C T P recA P recAT T G A T AT T G A T A T A T A A T T A T A A T 启动子 转录调控机理 具有多顺反子构造，基因陈列次序为： 启动子〔lacP〕- 支配基因〔lacO〕 - 构造基因〔lacZ-lacY-lacA〕 正调理因子 CAP 负调理因子 lac I 启动子Lac 表达系统 以大肠杆菌 lac 支配子调控机理为根底设计、构建的表达系统  lacI Plac lacO lacZ lacY lacA高效转录cAMPCAP lacI Plac lacO lacZ lacY lacARNA聚合酶基底程度转录Lac 表达系统 正调理因子 CAP cAMP激活CAP，CAP–cAMP复合物与 lac 支配子上专注位点结合 后，能促进 RNA 聚合酶与 –35、–10 序列的结合，进而促进 Plac 介导的转录。

RNA聚合酶RNA聚合酶基因工程中运用的 lac 启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即 Plac UV5 cAMP葡萄糖代谢cAMP浓度降低cAMPCAPCAPLac 表达系统 lac UV5 突变体 Plac UV5 突变体可以在没有 CAP 存在的情形下非常有效的起始 转录，受它控制的基因在转录程度上只受 lacI 的调控，因此用它 构建的表达载体在运用时比野生型 Plac 更易操作Lac 表达系统 负调理因子 lac I 在无诱导物情形下， lacI 基因产物构成四聚体阻遏蛋白，与启动 子下游的支配基因严密结合，阻止转录的起始 lacI Plac lacO lacZ lacY lacARNA聚合酶基底程度转录 lacI Plac lacO lacZ lacY lacA高效转录RNA聚合酶IPTGmRNATac 表达系统 tac 启动子是由 trp 的 –35 序列和 lacUV5 的 –10 序列拼接而成的杂 合启动子。

调控方式与 lacUV5 类似，但 mRNA 转录程度更高于 trp 和 lacUV5 启动子〔P tac = 3 P trp = 11 P lac〕，因此在要求有较高基因表达 程度的情况下，选用 tac 启动子比用 lacUV5 启动子更优越启动子启动子-35 -35 区序列区序列-10 -10 区序列区序列 P lac P lacT T T A C A T T T A C A T A T A A TT A T A A T P trp P trp T T G A C AT T G A C AT T A A C TT T A A C T P tac P tacT T G A C AT T G A C AT A T A A TT A T A A T lac、tac 启动子对宿主菌的要求 在普通大肠杆菌中， LacI 阻遏蛋白仅能满足细胞染色体上 lac 支配子 转录调控的需求 当多拷贝的 lacO 随着带有 lacUV5、tac 启动子的表达质粒转化进入 大肠杆菌后，LacI 阻遏蛋白与 lacO 的比例显著下降，无法保证每一 个 lacO 都能获得足够的 LacI 阻遏蛋白参与转录调控。

表现为在无诱 导物存在的情形下， lacUV5、tac 启动子有较高的本底转录lac、tac 启动子对宿主菌的要求 为了使以 Lac、Tac 表达系统具有严紧调控外源基因转录的才干，一 种能产生过量的 LacI 阻遏蛋白的 lacI 基因的突变体 lacIq 被运用于表 达系统 大肠杆菌 JM109 等菌株的基因型均为 lacIq ，常被选用为 Lac、Tac 表达系统的宿主菌 但是这些菌株也只能对低拷贝的表达载体实现严紧调控，在运用高拷 贝复制子构建表达载体时，仍能察看到较高程度的本底转录 需在表达载体中插入 lacIq 基因以保证有较多的 LacI 阻遏蛋白产生lac、tac 表达系统存在的问题 IPTG 用于诱导 lac、tac 启动子的转录，但由于 IPTG 本身具有一定的 毒性从平安角度，对表达和制备用于医疗目的的重组蛋白并不适宜 一些国家规定在消费人用重组蛋白质的消费工艺中不能运用 IPTG 处理方法 lac 和 tac 启动子的转录受温度严紧调控 乳糖替代 IPTG 诱导 lac 和 tac 启动子的转录lac、tac 表达系统存在的问题 lac 和 tac 启动子的转录受温度严紧调控 把阻遏蛋白 LacI 的温度敏感突变体lacI(ts)、lacIq(ts)插入表达载体或 整合到染色体后，均能使 lac 和 tac 启动子的转录遭到温度严紧调控 在较低温度〔30℃〕时抑制，在较高温度〔42℃〕时开放。

用乳糖替代 IPTG 诱导 lac 和 tac 启动子的转录 乳糖在 b-半乳糖苷酶作用下生成异乳糖，异乳糖具有诱导剂的作用 这一过程涉及乳糖的转运和转化，其效率遭到多种要素的影响和制约 因此乳糖诱导的有效剂量大大高于IPTG 乳糖本身作为一种碳源可以被大肠杆菌代谢利用，较多的乳糖存在也 会导致菌体生理及生长特性变化乳糖替代 lPTG 作为诱导剂的研讨 要与发酵工艺结合起来，才干显示其良好的前景 转录调控机理 色氨酸启动子 Ptrp 受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底 形状 在培育系统中去除色氨酸或者参与3-吲哚丙烯酸〔IAA〕， 便可有 效地解除阻遏抑制造用 在正常的细菌培育体系中，除去色氨酸是困难的，因此基因工程中 往往添加 IAA 诱导 Ptrp 介导的目的基因表达启动子Trp 表达系统 以大肠杆菌 trp 支配子调控机理为根底设计、构建的表达系统 Trp 表达系统 Ptrp OtrpRNA聚合酶基底程度转录高效转录mRNA Ptrp Otrp去除色氨酸高效转录mRNA Ptrp Otrp参与IAARNA聚合酶RNA聚合酶PL 和 PR 表达系统 以 l 噬菌体早期转录启动子 PL 、 PR 为中心构建的表达系统 在野生型 l 噬菌体中， PL 、 PR 启动子转录与否决议了 l 噬菌体进入 裂解循环还是溶源循环。

启动子PL 和 PR 表达系统 转录调控的机理 由 l 噬菌体 PE 启动子控制的 cI 基因的产物是 PL 、 PR 启动子转录的 阻遏物cI 基因的产物在大肠杆菌宿主中的浓度取决于一系列宿主与 噬菌体因子之间的错综复杂的平衡关系由于经过细胞因子来控制cI 基因产物的产生和消逝是相当困难的 因此 PL 、 PR 表达系统都选用温度敏感突变体 cI 857(ts) 的基因产物 来调控 PL 、 PR 启动子的转录 在较低温度〔30℃〕时以活性方式存在 在较高温度〔42℃〕时失活零落PL 和 PR 表达系统 宿主菌中没有 cI 基因产物，PL、PR 启动子的高强度直接转录，带有PL 或 PR 启动子的表达载体在普通大肠杆菌中相当不稳定 对宿主菌的要求 用溶源化 l 噬菌体的大肠杆菌作 PL、PR 启动子表达载体的宿主菌 N4830-1，POP2 等菌株曾经溶源化 cI 857(ts) l 噬菌体， 可用作表达外源基因时的宿主菌。

把 cI 857(ts) 基因组装在表达载体上 宿主菌选择范围更大PL 和 PR 表达系统存在的问题 由于 PL 和 PR 表达系统诱导时不加化学诱导剂，本钱又低廉，最初几 个在大肠杆菌中制备的药用重组蛋白质都采用 PL 或 PR 表达系统 缺陷 在热脉冲诱导过程中，大肠杆菌热休克蛋白的表达也会被激活，其 中一些是蛋白水解酶，有能够降解所表达的重组蛋白 在大体积发酵培育菌体时，经过热平衡交换方式把培育温度从30℃ 提高到 42℃ 需求较长的时间，这种缓慢的升温方式影响诱导效 果，对重组蛋白表达量有一定的影响 T7 表达系统表达系统 大大肠肠杆杆菌菌 T7 噬噬菌菌体体具具有有一一套套专专注注性性非非常常强强的的转转录录体体系系，，利用这一利用这一 体系中的元件为根底构建的表达系统称为体系中的元件为根底构建的表达系统称为 T7 表达系统。

表达系统 T7 表达系统 T7 噬菌体基因 1 编码的 T7 RNA 聚合酶选择性的激活 T7 噬菌体启 动子的转录 T7 RNA 聚合酶活性高，其合成 RNA 的速度比大肠杆菌 RNA 聚合 酶快 5倍左右并可以转录某些不能被大肠杆菌 RNA聚合酶有效转 录的序列 在细胞中存在 T7 RNA聚合酶和 T7噬茵体启动子的情形下，大肠杆 菌宿主本身基因的转录竞争不过 T7 噬菌体转录体系，最终受 T7噬 菌体启动子控制的基因的转录到达很高的程度T7 表达系统 转录调控的机理 T7 噬菌体启动子的转录完全依赖于 T7 RNA 聚合酶，因此 T7 RNA 聚合酶的转录调控方式就决议了表达系统的调控方式 化学诱导型 温度诱导型 双质粒系统T7 RNA 聚合酶T7 启动子 目的基因 T7 RNA 聚合酶基因？启动子 T7 表达系统 转录调控的机理 化学诱导型 噬菌体 DE3 是 l 噬菌体的衍生 株 ， 一 段 含 有 lacI、lacUV5 启 动子和 T7 RNA 聚合酶基因的 DNA 片段被插入其 int 基因中 用噬菌体 DE3 的溶源菌作为表 达载体的宿主菌，调控方式为 化学诱导型，类似于 Lac 表达 系统。

T7 RNA 聚合酶基因 lac 启动子E.Coli 〔DE3〕T7 启动子 目的基因T7 RNA 聚合酶IPTG诱导 T7 表达系统 转录调控的机理 温度诱导型 PL 启动子控制 T7 RNA 聚合 酶基因，经过热诱导方式激发 T7 噬菌体启动子的转录 这种方式可以使本底转录降到 很低的程度，尤其适用于表达 对大肠杆菌宿主有毒性的重组 蛋白质 T7 RNA 聚合酶基因 PL 启动子E.Coli 〔CE6〕T7 启动子 目的基因T7 RNA 聚合酶热诱导cI857 T7 表达系统 转录调控的机理 双质粒系统 一个质粒带有 T7 RNA 聚合酶 基因，另一个质粒带有 T7 启 动子和目的基因 两个质粒的复制子和抗性标志 不能一样 调控方式为控制 T7 RNA 聚合 酶的启动子调控类型T7 RNA 聚合酶热诱导T7 启动子 目的基因 T7 RNA 聚合酶基因 PL 启动子 cI857 p15A ori KanRColE1 ori AmpRT7 表达系统存在的问题 T7 表达系统表达目的基因的程度是目前一切表达系统中最高的，但 也不可防止出如今相对较高的本底转录，假设目的基因产物对大肠杆 菌宿主有毒性，会影响细胞的生长。

处理方法之一 在表达系统中低程度表达 T7 溶菌酶基因 由于 T7 溶菌酶除了作用于大肠杆菌细胞壁上肽聚糖外，还能与 T7 RNA 聚合酶结合抑制其转录的活性 目前 T7 溶菌酶基因都经过共转化质拉导入表达系统，它能明显 降低本底转录，但对诱导后目的基因的表达程度无明显影响  营养调控型 采用大肠杆菌碱性磷酸酯酶基因 phoA 启动子或甘油 3’-磷酸转移系 统 ugp 启动子构建表达载体 这两个启动子受在培育基中的无机磷〔Pi〕浓度调控〔Pi﹥5mmol/L 时抑制，Pi﹤1mmol/L 时激活)，具有较高的转录程度其他表达系统其他表达系统 糖原调控型糖原调控型 采用的有大肠杆菌半乳糖转移系统〔采用的有大肠杆菌半乳糖转移系统〔mglBAEC) mgl mglBAEC) mgl 启动子或启动子或沙门沙门 氏菌阿拉伯糖基因氏菌阿拉伯糖基因 araB araB 启动子构建表达载体。

启动子构建表达载体 这两个启动子受葡萄糖抑制，岩藻糖和阿拉伯糖是它们的诱这两个启动子受葡萄糖抑制，岩藻糖和阿拉伯糖是它们的诱导物 其调控机理类似于其调控机理类似于 Lac Lac 表达系统表达系统. .其他表达系统其他表达系统 pH调控型 采用大肠杆菌赖氨酸脱羧酶基因 cadA 启动子构建表达载体 cadA 启动子受培育基中 H+ 浓度，即 pH 值调控〔在pH﹥8 时抑 制，pH ﹤ 6时激活，pH = 6时转录活力最高〕 该表达系统要求菌体发酵温度控制在 27 ～30℃ 之间才干使目的基 因得到稳定的表达.其他表达系统其他表达系统溶氧调控型 采用大肠杆菌丙酮酸甲酸裂解酶基因 pfl 启动子，硝基复原酶基 因nirB 启动子或透明颤菌血红蛋白基因 vgb 启动子构建表达载 体。

这些启动子中都含有对氧呼应的调理因子 fnr 的作用位点 在富氧条件下转录被抑制，在贫氧或微氧条件下转录被激活其他表达系统其他表达系统溶氧调控型 大肠杆菌 GJ100 有透明颤菌血红蛋白基因〔vgb〕启动子控制下 的 T7 RNA 聚合酶基因表达质粒， vgb 基因的转录是受环境溶氧 浓度调控的，在贫氧条件下 vgb 基因的启动子被激活 因此，用大肠杆菌GJ100 作为宿主时，表达系统调控方式为贫氧 诱导型， 菌体发酵时的溶氧浓度可以经过控制搅拌转速和通气量 加以调理，与其他调控方式相比更适宜于产业化消费过程其他表达系统其他表达系统生物素调控型 用大肠杆菌生物素支配子及其调控区构建表达载体，菌体生长过程 中生物素会不断耗费，当浓度到达 2ng/ml 以下时启动子被激活 可以在没有外界的物理，化学信号的介入条件下自动诱导表达目的 基因是这类表达载体的特点，其缺陷是不容易准确控制自动诱导的 时辰其他表达系统其他表达系统强化转录终止的必要性 外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头景象，即 RNA 聚合酶滑过终止子构造继续转录质粒上临近的 DNA 序列，形生长短不一的 mRNA 混合物过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其缘由如下： 转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子 mRNA 所需的时间就相应添加，外源基 因本身的转录效率下降； 假设外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或 DNA功能区域，如选择性标 记基因和复制子构造等，那么 RNA聚合酶在此处的转录能够干扰质粒的复制及其 它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性； 过长的 mRNA 往往会产生大量无用的蛋白质，添加工程菌无谓的能量耗费； 更为严重的是，过长的转录物往往不能构成理想的二级构造， 从而大大降低外 源基因编码产物的翻译效率终止子强终止子的选择与运用 目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌 rRNA 支配子上 的 rrnT1T2 以及 T7 噬菌体 DNA 上的 Tf。

对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特 殊构造，以加强其转录终止作用终止子核糖体结合位点 外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频 率，而且在很大程度上还与 mRNA 的翻译起始效率亲密相关 大肠杆菌细胞中构造不同的 mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍 mRNA 翻译的起始效率主要由其 5‘ 端的构造序列所决议，称为核糖体结合位点〔RBS〕 核糖体结合位点核糖体结合位点 大肠杆菌核糖体结合位点包括以下四个特征构造要素： 位于翻译起始密码子上游的 6–8 个核苷酸序列 5’ UAAGGAGG 3’ 即Shine-Dalgarno〔SD〕序列，它经过识别大肠杆菌核糖体小亚 基中的 16S rRNA 3’ 端区域 3’ AUUCCUCC 5’ 并与之专注性结合 将mRNA 定位于核糖体上，从而启动翻译； 翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以 AUG作为阅读框架的 起始位点，有些基因也运用 GUG 或 UUG 作为翻译起始密码子 SD 序列与翻译起始密码子之间的间隔及碱基组成 基因编码区 5’ 端假设干密码子的碱基序列核糖体结合位点核糖体结合位点对外源基因表达的影响 SD 序列的影响 普通来说，mRNA 与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就 越高，而这种结合程度主要取决于 SD 〔 UAAGGAGG〕序列与 16S rRNA 的碱基互补性，其中以 GGAG 四个碱基序列尤为重要。

对多数基因此言，上述四个碱基中任何一个换成 C 或 T，均会导 致翻译效率大幅度降低核糖体结合位点核糖体结合位点对外源基因表达的影响 SD 序列与起始密码子之间的序列的影响 SD 序列下游的碱基假设为 AAAA 或 UUUU，翻译效率最高；而 CCCC 或 GGGG 的翻译效率那么分别是最高值的 50% 和 25% 紧邻 AUG 的前三个碱基成份对翻译起始也有影响 对于大肠杆菌 b-半乳糖苷酶的 mRNA 而言，在这个位置上最正确 的碱基组合是 UAU 或 CUU，假设用 UUC、UCA 或 AGG 取代 之，那么酶的表达程度低 20 倍核糖体结合位点核糖体结合位点对外源基因表达的影响 SD 序列与起始密码子之间的间隔的影响 SD 序列与起始密码子 AUG 之间的准确间隔保证了 mRNA 在 核糖体上定位后，翻译起始密码子 AUG 正益处于核糖体复合物 构造中的 P 位，这是翻译启动的前提条件。

在很多情况下，SD 序列位于 AUG 之前大约七个碱基处，在此 间隔中少一个碱基或多一个碱基， 均会导致翻译起始效率不同 程度的降低核糖体结合位点核糖体结合位点对外源基因表达的影响 起始密码子及其后续假设干密码子的影响 大肠杆菌中的起始 tRNA 分子可以同时识别 AUG、GUG 和 UUG 三种起始密码子，但其识别频率并不一样，通常 GUG 为 AUG 的 50%，而 UUG 只及 AUG 的 25% 除此之外，从 AUG 开场的前几个密码子碱基序列也至关重要，至 少这一序列不能与 mRNA 的 5’ 端非编码区构成茎环构造，否那么便 会严重干扰 mRNA 在核糖体上的准确定位 目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有与 启动子来源一样的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最正确的。

核糖体结合位点 不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子运用频率并不一样，具有一定的偏爱性，其决议要素是：生物基因组中的碱基含量 在富含 AT 的生物〔如单链 DNA噬菌体φX174〕基因组中，密码子 第三位上的 U 和 A 出现的频率较高； 在 GC 丰富的生物〔如链霉菌〕基因组中，第三位上含有 G 或 C 的 简并密码子占 90% 以上的绝对优势密码子与反密码子相互作用的自在能 性中等强度规律 如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU 等运用少 如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG 等运用多细胞内 tRNA 的含量密码子生物体对密码子的偏爱性密码子密码子偏爱性对外源基因表达的影响 由于原核生物和真核生物基因组中密码子的运用频率具有较大程大的差别性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要要素是密码子的正确选择 普通而言，有两种战略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最正确表达： 外源基因全合成 同步表达相关 tRNA 编码基因质粒拷贝数质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响 目前实验室里广泛运用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。

质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达程度的下降 处理上述难题的一种有效战略是将重组质粒的扩增纳入可控制的轨道 外源基因在大肠杆菌中的表达蛋白质的合成是在细胞之中进展的 目的蛋白在细胞质中表达的主要优点是： 表达质粒的构建比较简单； 可以到达很高的目的蛋白表达量，普通可以到达占细胞总蛋白的 20%～40% 目的蛋白在大肠杆菌系统表达的方式有二种： 在细胞内表现为不溶性的包涵体颗粒 包涵体存在于大肠杆菌细胞质中 在细胞内表现为可溶性的蛋白质 可溶性的目的蛋白质除可存在于细胞质中外，还可借助于本身的 功能序列和大肠杆菌蛋白质加工、运输体系，最终分泌到周质空 间，或外泌到培育液中大肠杆菌基因工程菌的构建战略 包涵体型异源蛋白的表达 分泌型异源蛋白的表达 交融型异源蛋白的表达 寡聚型异源蛋白的表达 整合型异源蛋白的表达 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建外源基因在大肠杆菌中的表达包涵体及其性质 在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或构成无膜裸露构造，这种水不溶性的构造称为包涵体〔Inclusion Bodies，IB〕。

富含蛋白质的包涵体多见于生长在含有氨基酸类似物培育基的大肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能，从而集聚构成包涵体 由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白质，后者在普通情况下也以包涵体的方式存在于细菌细胞内 除此之外，包涵体中还含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子包涵体型异源蛋白的表达以包涵体方式表达目的蛋白的优缺陷 包涵体表达方式的优点 在一定程度上坚持表达产物的构造稳定 可以防止细胞内蛋白水解酶的作用，有利于目的蛋白的富集 简化外源基因表达产物的分别操作 包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌 体经超声波裂解后，直接经过高速离心即可将重组异源蛋白从细 菌裂解物中分别出来 可以表达对大肠杆菌宿主有毒或有致死效应的目的蛋白包涵体型异源蛋白的表达以包涵体方式表达目的蛋白的优缺陷 包涵体表达方式的缺陷 以包涵体方式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必需经过 有效的变性复性操作，才干回收得到具有正确空间构象〔因此具 有生物活性〕的目的蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目的 产物的收率至关重要。

经过复性处置的目的蛋白不一定能完全恢复原来的生物学活性， 有时甚至完全得不到有活性的蛋白蛋，尤其当目的蛋白分子中的 Cys残基数目较高时，体外复性蛋白质的胜利率相当低， 普通不 超越 30% 复性处置工艺可使目的蛋白的制备本钱上升包涵体型异源蛋白的表达包涵体的变性与复性操作 包涵体的溶解与变性 包涵体的溶解与变性的主要义务是拆开错配的二硫键和次级键在 人工条件下，使包涵体溶解并重新进入复性途径中 能有效促进包涵体溶解变性的试剂和条件包括： 清 洗 剂 SDS、正十二醇肌氨酸，廉价， 但影响复性和纯化 促 溶 剂 盐酸胍、尿素，前者昂贵，尿素廉价， 但常被自发 构成的氰酸盐污染， 后者能与多肽链中的氨基反响 混合溶剂 如尿素与醋酸、二甲基砜等结合运用， 溶解力加强 极 端 pH 廉价，但许多蛋白质在极端pH条件下发生修饰反响包涵体型异源蛋白的表达包涵体的变性与复性操作 包涵体的复性与重折叠〔refolding〕 包涵体的复性与重折叠的主要义务： 将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠 经过次级键的构成使蛋白质复性包涵体型异源蛋白的表达在细胞内表现为可溶性的蛋白质 目的蛋白以可溶性蛋白质方式表达虽然可以防止包涵体复性带来的问题，但是也有一定的缺陷，主要表现为大肠杆菌本身存在于细胞质中的蛋白质往往只含有少量的，甚至没有半胱氨酸残基。

富含半胱氨酸残基，需求构成二硫键的蛋白质大部份被转运到细胞的其他部位 分泌型异源蛋白的表达 这是由于大肠杆菌细胞质微环境的氧化复原态势不利于蛋白质二硫键的构成，而且短少一种构成二硫键所必需的体系一些需求经过二硫键的构成来维持其构象的目的蛋白在大肠杆菌的细胞质中往往不能正确折叠 处理这一问题的途径之一是用大肠杆菌氧硫还蛋白复原酶基因 trxB 缺陷株作为宿主菌表达目的蛋白研讨阐明trxB 缺陷株细胞质的氧化复原态势发生了变化，蛋白质在 trxB 缺陷株的细胞质中可以构成二硫键这一菌株对于表达构造复杂的蛋白质而言是一·个相当重要的工具分泌型异源蛋白的表达在在细胞胞质中直接表达不中直接表达不带有前有前导序列的成熟蛋白序列的成熟蛋白质 在在细胞胞质中中直直接接表表达达不不带有有前前导序序列列的的成成熟熟蛋蛋白白质需需求求起始密起始密码，通常，通常为编码甲硫氨酸的甲硫氨酸的 ATG ⑴⑴ 在在多多数数情情况况下下，，N 端端附附加加的的甲甲硫硫氨氨酸酸对蛋蛋白白质的的性性质没没有有特特别的的影影响响，，但但是是也也有有附附加加的的甲甲硫硫氨氨酸酸严重重影影响响蛋蛋白白质生生物学活力的物学活力的报道。

道 ⑵⑵ 另另外外，，附附加加的的甲甲硫硫氨氨酸酸也也能能够改改动蛋蛋白白质的的免免疫疫性性质和和药理理性性质从从制制备用用于于医医疗目目的的的的蛋蛋白白质的的角角度度来来看看，，这是是一个需求引起注重的一个需求引起注重的问题 去除附加的甲硫氨酸有二种方法：去除附加的甲硫氨酸有二种方法： ⑴ ⑴ 在表达系在表达系统中共表达甲硫氨酸氨中共表达甲硫氨酸氨肽酶基因 ⑵ ⑵ 在分在分别纯化后在体外用外化后在体外用外肽酶处置 但但它它们都都对与与甲甲硫硫氨氨酸酸相相邻的的氨氨莱莱酸酸残残基基类型型有有一一定定要求，因此在运用上有一定的限制要求，因此在运用上有一定的限制目的蛋白与有亲合配基的序列交融表达目的蛋白与有亲合配基的序列交融表达 与纯化包涵体相比，细胞质中以可溶性方式表达蛋白质的与纯化包涵体相比，细胞质中以可溶性方式表达蛋白质的分别纯化过程比较复杂，普通要经过亲合层析才干到达比较高分别纯化过程比较复杂，普通要经过亲合层析才干到达比较高的纯度 目的蛋白与有亲合配基的序列交融表达既可以提高分别纯目的蛋白与有亲合配基的序列交融表达既可以提高分别纯化的效率，又能在交融蛋白切离的过程中得到没有附加甲硫氨化的效率，又能在交融蛋白切离的过程中得到没有附加甲硫氨酸目的蛋白。

酸目的蛋白 金黄色葡萄球菌蛋白金黄色葡萄球菌蛋白G、、A和衍生物和衍生物Z，日本血吸虫谷胱，日本血吸虫谷胱甘肽甘肽-S-转移酶，大肠杆菌麦芽糖结合蛋白，转移酶，大肠杆菌麦芽糖结合蛋白，His-tag 等是目前等是目前常用的与目的基因交融表达的序列常用的与目的基因交融表达的序列目的蛋白在周目的蛋白在周质空空间中表达中表达目的蛋白在周目的蛋白在周质空空间中表达的中表达的优点点 ⑴⑴ 大大肠杆菌周杆菌周质空空间中本身蛋白中本身蛋白质的数量的数量约为 100 种，只种，只占菌体占菌体总蛋白数量的蛋白数量的4%蛋白水解蛋白水解酶的含最与在的含最与在细胞胞质中相中相比也少得多，因此目的蛋白在周比也少得多，因此目的蛋白在周质空空间中表达有利于分中表达有利于分别纯化化和减少蛋白水解和减少蛋白水解酶的降解 ⑵⑵ 目的蛋白从目的蛋白从细胞胞质转运到周运到周质空空间过程中信号程中信号肽被加工被加工切除，有效地防止了切除，有效地防止了N 端附加的甲硫氨酸的端附加的甲硫氨酸的产生 ⑶⑶ 周周质空空间中呈氧化型的氧化复原中呈氧化型的氧化复原态势使目的蛋白可以使目的蛋白可以较好折叠，好折叠，维持正确的构象。

持正确的构象目的蛋白外泌表达目的蛋白外泌表达 把把所所表表达达的的目目的的蛋蛋白白外外泌泌到到细细胞胞外外的的培培育育基基中中可可以以进进一一步步减少蛋白水解酶的降解，也有利于分别纯化减少蛋白水解酶的降解，也有利于分别纯化 目前胜利的例子主要是采用以下方案目前胜利的例子主要是采用以下方案: 〔〔1〕与大肠杆菌本身的外泌蛋白基因交融表达〕与大肠杆菌本身的外泌蛋白基因交融表达 〔〔2〕与一些能提高细胞外膜通透性的因子交融或共表达〕与一些能提高细胞外膜通透性的因子交融或共表达 〔〔3〕改动培育基的成分〕改动培育基的成分 归归纳纳现现有有的的研研讨讨结结果果显显示示这这些些方方法法仅仅对对外外泌泌分分子子量量较较小小的的蛋蛋白有效，而且外泌效率普通都比较低白有效，而且外泌效率普通都比较低四、高效表达目的基因的战略和技术四、高效表达目的基因的战略和技术表达质粒的优化和设计共表达大肠杆菌稀有密码子 tRNA 基因提高目的基因 mRNA 和目的基因产物的稳定性高密度发酵和工程化宿主细胞四、高效表达目的基因的战略和技术四、高效表达目的基因的战略和技术表达质粒的优化和设计 在各种表达载体中，启动子和 SD序列的下游都设计了一段含有各种限制性酶切位点的序列，用于目的基因的插入。

这一插入位点附近的序列将成为核糖体结合位点的一部分，因此它对于构建高效表达质粒是至关重要的 由于每一个基因都具有各自独特的 5’ 端构造，最终构建成的各种表达质粒所具有的核糖体结合位点是一个变量四、高效表达目的基因的战略和技术四、高效表达目的基因的战略和技术表达质粒的优化和设计 构建表达质粒时首先要思索使目的基因的翻译起始密码 ATG 与 SD 序列之间的间隔和碱基组成处于一个适当的范围内 核糖体结合位点序列的变化对 mRNA 的翻译效率有显著影响，详细表现为： SD 序列 UAAGGAGG 的翻译效率要比 AAGGA 高3～6倍 翻译起始密码 ATG 与 UAAGGAGG的最适间隔是 6～8 个碱基长度， 与 AAGAA 的最适间隔是5～7 个碱基长度 ATG 与 UAAGGAGG 至少相隔 3 ～ 4个碱基，与 AAGAA 至少相隔 5 个碱基； mRNA 的翻译才干进展 ATG 与 SD 序列之间的碱基组成为 A，T 碱基丰富时，mRNA 翻译效 率较高。

 核核糖糖体体结合合位位点点本本身身和和附附近近的的序序列列决决议了了目目的的基基因因 mRNA 5’ 端端的的二二级构构造造，，研研讨阐明明讨 mRNA 5’端端构构成成的的 “茎茎环〞〞 构构造造妨妨碍碍了了 mRNA 与与核核糖糖体体 30S 亚基基的的结合合，，从从而而抑抑制制了了翻翻译的的起起始 尽尽量量提提高高核核糖糖体体结合合位位点点本本身身和和附附近近的的序序列列中中 A/T 碱碱基基的的含含量量，，降降低低 mRNA 5’ 端端构构成成的的 “茎茎环〞〞 构构造造的的能能够性性，，也也是是构构建表达建表达质粒粒时需求留意的事需求留意的事项 在在必必要要的的情情况况下下，，还可可经过定定点点突突变，，PCR 等等技技术改改动个个别关关键的碱基来破坏的碱基来破坏 mRNA 5’ 端的端的 “茎茎环〞〞 构造构造 把把目目的的基基因因设计成成多多顺反反子子构构造造，，在在大大肠杆杆菌菌本本身身的的高高效效翻翻译起起始始元元件件后后加加上上第第二二个个 SD 序序列列和和目目的的基基因因，，一一同同插插入入表表达达载体体。

这一一方方法法通通常常适适用用于于目目的的基基因因 5’ 端端序序列列容容易易构构成成二二级构造，而又不宜改构造，而又不宜改动其序列的情形下其序列的情形下表达质粒的优化和设计 在构建表达质粒时，充分利用各个基因的构造特征和特点，留意引入翻译加强子序列 能提高 mRNA 翻译效率的特殊核苷酸序列，称为翻译加强子 四、高效表达目的基因的战略和技术四、高效表达目的基因的战略和技术共表达大肠杆菌稀有密码子 tRNA 基因 表达程度高的基因呈现的密码子偏爱性高于表达程度低的基因 现已阐明的在大肠杆菌中的稀有密码子有： 编码 Arg 的密码子 AGA、AGG、CGA、CGG 编码 Pro 的密码子 CCC、CCU、CCA 编码 Cys 的密码子 UGU、UGC; 编码 Gly 的密码子 GGA、GGG 编码 Leu 的密码子 CUA、CUC 编码 Ile 的密码子 AUA 编码 Ser 的密码子 UCA、AUG、UCG、UCC 编码 Thr 的密码子 ACA四、高效表达目的基因的战略和技术四、高效表达目的基因的战略和技术共表达大肠杆菌稀有密码子 tRNA 基因 由于同义密码子的运用频率与细胞内对应的 tRNA 的丰度有正比关系稀有密码子对应的 tRNA 的丰度很低，有能够在翻译过程中发生中止和移码突变。

处理这一问题的方法： 经过基因突变把稀有密码子改动为其他运用频率高的同义密码子 在表达系统中共表达稀有密码子 tRNA 基因，以提高大肠杆菌细胞 内稀有密码子 tRNA 的丰度四、高效表达目的基因的战略和技术四、高效表达目的基因的战略和技术 在一切的大肠杆菌稀有密码子 tRNA 中，tRNA Arg (AGG/AGA) 含量最少，而 AGG 和 AGA 密码子在真核基因中经常出现 人尿激酶原 ProUK，新型组织纤溶酶原激活剂 NTA 等基因中都含有较多的 AGG 和 AGA 密码子， 在大肠杆菌中直接表达的程度很低，但在大肠杆菌中共表达 tRNA Arg(AGG/AGA) 基因 argU 后， 这些基因的表达程度能明显得到提高 如今还没有一个固定规那么来断定稀有密码子的存在能否确实会对翻译过程产生明显的不利影响由于稀有密码子存在的位置、分布的均匀性、mRNA 的二级构造的不同决议了它对翻译过程的影响是有差别的一切的结论要经过实验才干得出四、高效表达目的基因的战略和技术四、高效表达目的基因的战略和技术提高目的基因 mRNA 和目的基因产物的稳定性 由于大肠杆菌防御体系的本身维护作用，大肠杆菌中的核酸酶和蛋白水解酶可以降解目的基因 mRNA 和目的基因产物，这种降解作用程度对不同的基因或蛋白质而言是不同的，具有一定的专注性和选择性。

四、高效表达目的基因的战略和技术四、高效表达目的基因的战略和技术蛋白水解酶的特点 细胞质是蛋白水解酶含量最多的区域，目的蛋白在细胞质中最容易受 到蛋白水解酶的作用 经过对知大肠杆菌细胞内半衰期的蛋臼质的统计学分析，发现 N末 端为Arg 、 Lys 、 Leu 、 Phe 、 Tyr 、 Trp 残基的蛋白质，含有Pro Glu 、Ser 、Thr 丰富区的蛋白质容易降解，稳定性较差 在细胞内有多肽碎片、突变的异常蛋白和外界物理要素的刺激的条件 下，大肠杆菌细胞内的蛋白水解酶活力往往能到达比较高的程度四、高效表达目的基因的战略和技术四、高效表达目的基因的战略和技术提高目的蛋白的稳定性的措施主要有： 利用蛋白转运系统把目的蛋白最终累积在周质空间，或分泌到培育基中 采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作为宿主菌 对分子量较小的目的基因进展交融表达或串联聚合表达 共表达能提高特定目的蛋白稳定性的辅助因子，如分子伴侣基因 对蛋白质序列中的蛋白水解酶敏感区域和识别位点进展改造。

在较低的温度下培育菌体和优化发酵条件四、高效表达目的基因的战略和技术四、高效表达目的基因的战略和技术 但但必必需需指指出出的的是是，，由由于于目目的的蛋蛋白白本本身身的的性性质质和和用用途途的的不不同同，，上上述述几几种种方法在运用上是遭到一定的限制的主要表现为：方法在运用上是遭到一定的限制的主要表现为： 大大肠肠杆杆菌菌对对分分子子量量较较大大的的目目的的蛋蛋白白的的较较运运和和分分泌泌效效率率普普通通比比较较低低，，不不能满足大规馍制备的需求能满足大规馍制备的需求 蛋蛋白白水水解解酶酶含含量量低低的的菌菌株株往往往往代代谢谢不不旺旺盛盛，，生生长长速速率率慢慢，，使使高高密密度度发发酵比较困难酵比较困难 交交融融表表达达使使目目的的蛋蛋白白的的构构象象与与天天然然形形状状不不一一样样，，导导致致生生物物比比活活力力降降低低，，甚至没有活性甚至没有活性 交交融融蛋蛋白白和和串串联联聚聚合合蛋蛋白白需需求求用用酶酶或或化化学学的的方方法法切切割割出出单单体体目目的的蛋蛋白白酶酶法法本本钱钱比比较较高高且且参参与与的的酶酶蛋蛋白白还还必必需需分分别别去去除除。

化化学学法法比比酶酶法法本本钱钱低低，，但不少裂解试剂有毒性但不少裂解试剂有毒性 对对蛋蛋白白质质序序列列进进展展改改造造需需求求有有根根本本的的蛋蛋白白质质构构造造数数据据，，而而目目前前这这方方面面的数据库还不完好的数据库还不完好四、高效表达目的基因的战略和技术四、高效表达目的基因的战略和技术高密度发酵和工程化宿主细胞 大肠杆菌高密度发酵是大规模制备重组蛋白质过程中不可短少的工艺步骤其目的是在单个菌体对目的基因的表达程度根本不变的前提下，经过单位体积的菌体数量的成倍添加来实现总表达量的提高 目前常用的发酵方式有：恒定培育、流加补料培育、延续培育三种 构建出产乙酸才干低的工程化宿主菌 高密度发酵后期由于菌体的生长密度较高，培育基中的溶氧饱和度往往比较低，氧气的缺乏导致菌体生长速率降低和乙酸的累积，乙酸的存在对目的基因的高效表达有明显的阻抑作用这是高密度发酵工艺研讨中最迫切需求处理的问题 虽然在发酵过程中可采取通氧气，提高搅拌速度，控制补料速度等措施来控制溶氧饱和度，减少乙酸的产生但从实践运用上看，这些措施都有一定的滞后效应，难以做到比较准确的控制。

因此构建出产乙酸才干低的工程化宿主菌，是从恨本上处理问题的途径之一四、高效表达目的基因的战略和技术四、高效表达目的基因的战略和技术 利用透明颤菌血红蛋白能提高大肠杆菌在贫氧条件下对氧的利用率的生物学性质，把透明颤菌血红蛋白基因 vgb 导入大肠杆菌细胞内以添加其对溶氧的宽容度从而降低菌体产生乙酸所要求的溶氧饱和度阀值 用基因敲除技术缺失大肠杆菌的磷酸转乙酰酶基因 pta1 和乙酸激酶基因ackA，使从丙酮酸到乙酸的合成途径被阻断 改动代谢流的方向，经过共转化把枯草杆菌、酿酒酵母的乙酰乳酸合成酶基因 alsS，单胞菌的丙酮酸脱羧酶基因 pdc1 和乙醇脱氢酶基因 adh2 导入大肠杆菌，使丙酮酸的代谢有选择地向生成3‘-羟基丁酮或乙醇的方向进展四、高效表达目的基因的战略和技术四、高效表达目的基因的战略和技术构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌 对于以可溶性或分泌方式表达的目的蛋日而言，随着发酵后期各种蛋白水解酶的累积，目的蛋白会遭到蛋白水解酶的作用而被降解为了使对蛋白水解酶比较敏感的目的蛋白也能获得较高程度的表达，需求构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌。

rpoH 基因编码大肠杆菌 RNA 聚合酶的 r32 亚基， r32 亚基对大肠杆菌中多种蛋白水解酶的活力有正调控作用 rpoH 基因缺陷的突变株己经被构建，研讨结果阐明它能明显提高目的基因的表达程度到目前为止，知的大肠杆菌蛋白水解酶基因缺陷的突变株都巳被获得，其中一部分具有实践运用的潜力四、高效表达目的基因的战略和技术四、高效表达目的基因的战略和技术五、大肠杆菌表达系统研讨的开展趋势五、大肠杆菌表达系统研讨的开展趋势构建各种表达载体 建立新的表达系统 目前研讨的重点完善现有的表达系统，处理表达系统中还存在的缺陷 等方面这些研讨任务主要包括: 重组蛋白质的正确折叠、构象构成和分泌 菌体外表表达技术及其运用 重组蛋白质修饰加工研讨共表达与蛋白质折叠过程亲密相关的分子伴侣 包涵体是由于在新合成的大量目的蛋白质的折叠过程中，大肠杆菌细胞内参与折叠的蛋白因子的量不能满足需求，无法构成正确的构象而产生的，因此在大肠杆菌内共表达与蛋白质折叠过程亲密相关的分子伴侣，折叠酶或硫氧还蛋白基因可以使目的基因可溶性表达的比例明显上升。

研讨阐明这种作用是具有专注性的，不同的目的蛋白需求不同类型的蛋白因子共表达在有些情况下需求有多个蛋白因子共表达才干到达预期的目的五、大肠杆菌表达系统研讨的开展趋势五、大肠杆菌表达系统研讨的开展趋势共表达人或小鼠的二硫键异构酶、促进二硫键构成和正确折叠 大肠杆菌周质空间经过二硫键构成酶 DsbA 和 DsbB 二个蛋白维持适 当的氧化复原态势使蛋白质的二硫键构成 共表达人或小鼠的蛋白质二硫键异构酶〔PDl〕 PDl 能互补 dsbA 缺陷株，但在 dsbB 缺陷株中 PDl 失去原有的 功能; PDl 对目的蛋白的二硫键构成和正确折叠的促进作用可以遭到谷 胱甘肽的调理 PDI 具有的二硫键异构，交换功能有效地弥补了 DsbA 和 DsbB 功能上的缺乏，从而提高了目的蛋白正确折叠的比例五、大肠杆菌表达系统研讨的开展趋势五、大肠杆菌表达系统研讨的开展趋势降低蛋白质合成的速率，从而添加正确折叠重组蛋白质 从 phoA 基因合成速率低的突变株中发现其分泌在周质空间的 phoA 基 因的产物------碱性磷酸酯酶比野生型菌株有显著添加，由于只需构象正 确的酶原才干被大肠杆菌蛋白转运系统识别和分泌，这一结果阐明了目 标蛋白合成的速率能对其构象构成正确与否产生影响。

采用较弱的启动子或部分诱导强启动子的方法可降低蛋白质合成的速 率，从而到达添加正确折叠重组蛋白质的目的五、大肠杆菌表达系统研讨的开展趋势五、大肠杆菌表达系统研讨的开展趋势改造信号肽的序列和构造，提高分泌效率 改造信号肽的序列和构造，提高分泌效率 比较胜利的例子是发现了把碱性磷酸酯酶基因 phoA 信号肽的疏水区 置换为多聚 Leu 残基能明显提高分泌效率阐明信号肽中心部位疏水 性的加强有利于它与细胞膜的相互作用这一结果为天然信号肽优化 改造的设计提供了很好的参考根据五、大肠杆菌表达系统研讨的开展趋势五、大肠杆菌表达系统研讨的开展趋势大肠杆菌外表表达技术的建立 膜蛋白基因在大肠杆菌中表达的技术逐渐成为研讨的热点领域，膜蛋 白表达技术的开展促进了大肠杆菌外表表达技术的建立 外源蛋白质在菌体外表表达的优点是大肠杆菌可直接用于制备疫苗， 进展生物催化和作为探针挑选药物在一定程度上能与噬菌体展现系 统相媲美。

五、大肠杆菌表达系统研讨的开展趋势五、大肠杆菌表达系统研讨的开展趋势大肠杆菌外表表达技术的建立 主 要 经 过 三 条 途 径 使 目 的 蛋 白 呈 如 今 菌 体 外 表 : 把外源序列插入 LamB 、OmpA、PhoE 等外膜蛋白的膜外区 把外源蛋白导入大肠杆菌鞭毛或伞毛的构造中 这二种方法适宜表达一段长度小于 100 个氨基酸残基的外源序列， 由于较大的外源序列的插入往往会使外膜蛋白不能构成原来的三维 构 造 ， 影 响 它 转 运 过 程 和 在 膜 上 的 定 位 在脂蛋白、IgA 蛋白酶、 ompA 基因的 N 端或 C 端交融外源基因 这种交融表达的方法对外源基因的限制条件就比较小，其序列可在 50 到 500 氨基酸残基长度的范围内五、大肠杆菌表达系统研讨的开展趋势五、大肠杆菌表达系统研讨的开展趋势重组蛋白质修饰加工研讨 蛋白质 C末端酰胺化和侧链糖基化是常见的翻译后修饰加工类型 目前 C末端酰胺化普通都是在体外经过肽酰甘氨酸酰胺酶把 C末端甘氨酸转换为胺基 把其他微生物的肽酰甘氨酸酰胺化酶，真核生物糖基化过程所涉及的酶系导入大肠杆菌的想象很早就被提出，但这些任务都还在探求之中。

其中需求研讨的主要问题有: 如何使肽酰甘氨酸酰胺化酶在大肠仟菌内有较高的活力和专注性; 如何经过基因工程技术改道真核生物的糖基化多酶体系使其能整合到 大肠杆菌的染色体中和对耱基化位置、糖基种类和长度进展控制等五、大肠杆菌表达系统研讨的开展趋势五、大肠杆菌表达系统研讨的开展趋势。