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授课教师：李晓坤生物化学与分子生物学教研室 邮箱： ：15836103539生物化学生物化学1Genetic Recombination & Genetic Engineering基因重组与基因工程基因重组与基因工程第十四章第十四章2第一节：DNA的重组第二节：重组DNA技术第三节：重组DNA技术与医学的关系本章主要内容3二、重组二、重组DNADNA技术的基本原理与操作技术的基本原理与操作 基本原理 (基本过程)：目的基因的获取DNA导入受体菌目的基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选目的基因的表达 5 SSSS基因基因基因载体基因载体重组体重组体分分切切接接转转筛筛表表SS6 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程7（一）目的基因的获取1. 化学合成法2. 基因组DNA文库 (genomic DNA library)3. cDNA文库 (cDNA library)4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)8DNA合成仪已知核苷酸序列目的DNA（合成的片段较小）1. 化学合成法获取目的基因：91. 化学合成法获取目的基因： 由已知产物的氨基酸序列可以推测出基因可能的DNA序列。

小分子活性多肽基因的合成，如：人生长激素释放抑制因子、胰岛素原、脑啡肽及干扰素基因等 10基因组DNA文库：存在于转化细胞内，由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合2. 从基因组DNA文库获取目的基因：组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌11限制酶切位点限制酶消化 除去中间片段cos LR coscos L左臂R cos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化 外源DNA与载体DNA混合 连接反应 体外包装 用重组噬菌体感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段 cos LR cos20 Kb 外源 DNA 片段 基因组文库 图图141411 11 用随机切割的真核生物染色体用随机切割的真核生物染色体DNADNA片段构建基因文库片段构建基因文库123. 从cDNA文库获取目的基因： 逆转录酶A A A A T T T T AAAASI核酸酶 DNA聚合酶酶/碱水解 T T T T组织或培养细胞组织或培养细胞mRNA mRNA cDNAcDNA载体载体 cDNAcDNA与载与载体体DNADNA连接连接 导入大肠杆菌导入大肠杆菌 鉴定鉴定cDNAcDNA文库的克隆数与特性文库的克隆数与特性13DNA利用了DNA的变性和复制的机制：加热退火、延伸单链DNA复制的DNA双链引物、dNTP聚合酶PCR（ polymerase chain reaction ）: 即聚合酶链反应技术，是一种在体外利用酶促反应快速扩增特定核酸片段的技术。

4.聚合酶链反应(PCR)获取目的基因： 14PCR测序反应示意图变性(95)引物连接(Tm5)半保留复制 (72)反复循环15PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增 聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCRPCR）16目的基因目的基因克隆载体克隆载体重组体重组体（二）克隆载体的选择和构建克隆载体：为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体 选择和构建合适的载体是基因工程成功的关键步骤 载体的选择和构建要根据基因工程的目的目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改进方法也不同三）外源基因与载体的连接 将目的基因或序列插入载体（即DNA的体外重组），主要靠 DNA连接酶连接方式： 1. 粘性末端的连接 2. 平端连接 3. 同聚物加尾连接 4. 人工接头连接条件：末端碱基序列互补1. 粘性末端连接：方式：(1) 同一限制酶切位点连接 (2) 不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接（三）外源基因与载体的连接19Bam H切割反应 GGATCC CCTAGGGATCC GGCCTAG+目的基因用 Bam H切割载体DNA用Bam H切割DNA连接酶15C重组体同一限制酶切位点连接：不同限制酶切位点(配伍末端)的连接：配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。

Mbo 切割位点 GATC CTAGBamH 切割位点 G GATCC CCTAG GCTAGGATCC G GATCC CTAGG21不同限制酶切位点(非配伍末端)的连接：Eco R切割位点Bg l切割位点+ +EcoR+ Bg l双酶切Eco R+ Bg l双酶切DNA连接酶15C重组体连接方向一定22限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端适用于：2. 平端连接：目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶15C重组体载体自连目的基因 自连平端连接在末端转移酶 (terminal transferase) 的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接 3. 同聚物加尾连接：利用同聚物序列，比如多聚A与多聚T之间在退火作用下完成连接 属于粘性末端连接的一种特殊形式 这是人工提高连接效率的一种方法5335载体DNA5335目的基因限制酶或机械剪切限制酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT 35 5 3 353 A(A)nA A(A)nA 35-核酸外切酶-核酸外切酶末端转移酶+ dATP末端转移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶15C重组体5同聚物加尾连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。

4. 人工接头连接：对酶切产生的平端DNA片段，在连接前将磷酸化的接头连到平末端，使产生新的限制性核酸内切酶位点，再用识别新位点的限制性酶切除接头远端，产生粘性末端 也是粘性末端连接的一种特殊形式 人工接头连接Eco REco REco RCCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco R（四）重组DNA导入受体菌目的基因与载体在体外重组后要导入受体细胞才能进行扩增和表达 无性繁殖受体菌条件： 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent)29导入方式： 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection)感受态细胞： 选择合适受体菌后，可采取一些适当方法处理受体细胞，使其处于最容易接收重组体的状态，称为感受态细胞 细菌 真核细胞 哺乳动物 30（五）重组体的筛选 筛选 (screening) 是从大量细胞克隆中，得到含有目的基因的阳性重组子细胞或菌落的过程 根据载体体系、宿主细胞特性及外源基因在受体细胞的表达情况不同，可采取相应的筛选方法311. 直接选择法(1) 抗药性标记选择(2) 标志补救 (marker rescue)(3) 分子杂交法原位杂交Southern印迹2. 免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等（五）重组体的筛选 32（1）抗药性标志选择 利用携带某种抗药性标志基因的克隆载体进行筛选; 只有含这种抗药基因的转化细菌才能在含该抗生素的培养基上生存并形成菌落，从而区别转化菌和非转化菌。

如质粒pBR322: 含氨苄青霉素抗性基因 （Amp r）和四环素抗性基因（Tet r ）33(插入失活法)抗药性标记选择634（2）标志补救 是利用重组DNA和受体细胞之间基因产物的互补性来筛选重组体的方法n 如: 酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因、 pUC 质粒载体等 35组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因促进组氨酸合成DNA重组体标志补救36依据蓝白菌落的出现筛选鉴定重组与非重组菌落pUC质粒载体，含有为-半乳糖苷酶N-端-片段编码的基因突变型大肠杆菌可表达-半乳糖苷酶C-端的片段 单独-片段或片段均无-半乳糖苷酶活性 宿主细胞与克隆载体共表达时，才能形成完整的-半乳糖苷酶 分解发色底物，形成蓝色菌落，称为-互补 不能形成完整的-半乳糖苷酶，形成白色菌落互补：37 互补的检测38（3）分子杂交法 是利用探针与转移至硝酸纤维素膜上的 DNA片段进行分子杂交n探针：放射性如32P标记，且与目的基因同源n如：原位杂交、Southern blot 39原位杂交40Southern blot41（4）免疫学筛选法 适用于基因表达性载体的筛选 原理：抗原（表达产物）与抗体的免疫反应 优点：特异性强、灵敏度高。

42重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNA cDNA 人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交中文43重组DNA技术：分分离目的基因 切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体 转转入受体菌 筛筛选重组体 表达44（六）克隆基因的表达表达体系的建立: 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化基因工程的表达系统包括原核和真核表达体系 45E.Coli 表达体系的不足： 不宜表达真核基因组DNA 不能加工表达真核蛋白质 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 很难表达大量可溶性蛋白原核表达体系： E.coli 表达体系最为常用标准： 选择标志 强启动子 翻译调控序列 多接头克隆位点E.Coli 表达体系的优点：培养方法简单、迅速、经济，适合大规模生产工艺46 优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 缺点：操作技术难、费时、经济 转染 将表达载体导入真核细胞的过程真核表达体系： 酵母、昆虫、乳类动物细胞方法：磷酸钙转染、 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔、 脂质体转染、显微注射 47（1）外源目标基因的分离、克隆以及目标基因的结构与功能研究。

这一部分的工作是整个基因工程的基础，因此又称为基因工程的上游部分2）适合转移、表达载体的构建或目标基因的表达调控结构重组3）外源基因的导入4）外源基因在宿主基因组上的整合、表达及检测与转基因生物的筛选5）外源基因表达产物的生理功能的核实6）转基因新品系的选育和建立，以及转基因新品系的效益分析7）生态与进化安全保障机制的建立8）消费安全评价 一个完整的、用于生产目的的基因工程技术程序包括的基本内容有：48单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式*49目录第三节 重组DNA技术与医学的关系非常密切并前景远大DNA Recombination Technique is Closly Related with Medicine and has a Good Perspective一、疾病基因的发现与克隆 根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制脆性X综合征：(CGG)n重复序列 Kallmann综合征：KALIG-1基因缺失突变 比如：50n20世纪80年代，转基因微生物发酵，药用多肽；n目前，转基因动物，人类活性多肽；转基因动物： 采用基因工程技术，通过受精卵或早期胚胎细胞的基因转移，将外源基因与动物染色体结合，在动物体内得以表达并稳定的遗传给后代的一类动物。

51（二）生物制药动物药厂：通过转基因动物生产感兴趣的基因把 YFG 放在-乳球蛋白启动子下 注入羊卵细胞植入借腹怀孕母羊 YFG 在乳腺中表达 乳汁中提纯 YFG 蛋白 利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界的一项重大产业； 已有 50 多种基因工程药物上市，近千种处于研发状态； 2000 年我国基因工程药物和疫苗年销售额已达近 20 亿元 YFG：“你所宠爱的基因”(your favorite gene) 52（二）生物制药 英国PPT公司培育了植入人体基因的克隆羊，羊乳汁中含有能够治疗囊性纤维变性的人YFG蛋白囊性纤维变性：53 重组DNA医药产品预防霍乱口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗预防乙肝乙肝疫苗(CHO， 酵母)利用其结合特异性进行诊断试验、。