从小量样品中同时提取高分子量DNA和RNA.doc

KKME---专业医学搜索引擎 DNA 和和 RNA一、基本原理目前，提取 DNA 和 RNA 的方法有多种，但多为分别提取DNA 或 RNA，而不能由同一样品同时提取 DNA 和 RNA故常使需要同时研究同一样品中 DNA 和 RNA 的工作既浪费样品，又增加操作步骤，耗物耗时，还易使所得 DNA 和 RNA 产生一定程度的相互污染特别在样品的来源有限或样品量少的情况下，用分别提取的方法获得高分子量的 DNA 和 RNA 常顾此失彼，不能同时得到足够的产量本节介绍一种从少量样品中同时提取高分子量 DNA 和RNA 的方法，其优点如下：①只用一个样品，通过一次提取过程就可同时得到 DNA 和 RNA;②操作简便、迅速;③所得 DNA 和 RNA产量多，纯度高;④所得 DNA 和 RNA 比较完整，降解少两种不同浓度的 CsCl 加在一起，只要不搅乱两者之间的界面，两者就不会相互扩散，各自维持自己的密度本法首先用含异硫氰酸胍的细胞裂解液破碎细胞，使 DNA 和 RNA 从细胞中释放到细胞裂解液中，加 CsCl 至 3.0mol/L，然后转入预先放置了 5.7mol/LCsCl缓冲液的离心管中，超速离心。

高分子量 DNA 和蛋白质密度小于5.7mol/LCsCl 不能沉淀到管底，仍留在上清液中;而高分子量 RNA密度大于 5.7mol/LCsCl，可经 5.7mol/LCsCl 缓冲液而离心沉淀到管底这样就可把高分子量的 DNA 和 RNA 分开，然后分别收集上清液和沉淀，再经过透析、消化蛋白质与抽提等步骤就可同时获得同KKME---专业医学搜索引擎 DNA 和 RNA二、实验方法(一)器皿的处理 所用器皿必须经 180℃烘烤 8 小时(或 250℃，4 小时)不能烘烤的器皿应用 0.1%DEPC(diethylpyrocarbonate)浸泡过夜，然后高压消毒第一次使用的微量离心管和吸头，消毒后可直接使用，无需用 0.1%DEPC 处理二)溶液及配制 称取药品应用烤过的干净称量盘，所用的水为高压消毒过的双蒸水溶液配好后加 DEPC 使其含量为 0.1%，过夜，高压消毒后备用1.磷酸盐缓冲液(即 PBS，pH7.4)2.GITC(guanidiniumisothiocyanate)细胞裂解液：4.0mol/L 异硫氰酸胍、5.0mmol/L 柠檬酸钠(pH7.0)、0.5%sarcosyl，用时加 β-巯基乙醇至 0.1mol/L。

3.CsCl 缓冲液：5.7mol/LCsCl 和 0.01mol/LEDTA(pH7.5)4.饱和酚：用 1.0mol/LTris-HCl 缓冲液(pH7.5)饱和5.TE 缓冲液：10.0mmol/LTris-HCl 和 1.0mmol/LEDTA(pH7.5)6.5×蛋白酶 K 作用液：50.0mmol/LTris-HCl、50.0mmol/LEDTA、50.0mmol/LNaCl、2.5%SDS(pH7.5)用时加蛋白酶 K 至 500μg/ml7.氯仿-正丁醇抽提液：氯仿∶正丁醇=4∶1(V/V)8.无水乙醇和 70%乙醇9.异丙醇KKME---专业医学搜索引擎 10 瓶)，向每瓶加入 5.0mlPBS 缓冲液，轻轻冲洗瓶壁一次倒掉，然后加1.0mlGITC 细胞裂解液使其覆盖细胞，静置 30 分钟收集合并细胞裂解液共 10ml，加入 4.0gCsCl，使溶解均匀组织：取新鲜组织 1.0g，迅速用液氮冷冻，然后在研钵中研成粉末，收集粉末于匀浆器中，加入 10mlGITC 细胞裂解液，匀浆 10分钟，加入 4.0gCsCl，使溶解均匀2.超速离心：向离心管加入 1.2ml 的 5.7mol/LCsCl 缓冲液，用标记笔在液面上缘做一标记分界线，然后将细胞裂解液小心加于其上，勿搅乱两者之间的界面。

离心(105000×g，4℃，24 小时)3.RNA 的提取：(1)离心完毕，将标记分界线以上的上清液收集于透析袋中透析(见 DNA 提取部分);(2)将标记线以下残留的 5.7mol/LCsCl 缓冲液倒掉，可见管底有一无色透明胶冻状沉淀，即为 RNA用干净滤纸吸干管内残留液滴，室温下晾干;(3)加入 400μlTE 缓冲液，60℃下溶解 30 分钟后收集于 1.5ml的微量离心管中;(4)加入等体积的饱和酚，旋混均匀，离心(10000r/min，4℃，5分钟)将上清液转移至另一微量离心管中重复用饱和酚抽提一次;KKME---专业医学搜索引擎 2 倍体积无水乙醇旋混均匀，离心(10000r/min，4℃，20 分钟)，倾去上清液，管底沉淀物即为 RNA，加入 400μl70%的乙醇，-70℃保存7)使用前，使温度升至 4℃，离心(10000r/min，20 分钟)，倾去上清液，真空抽干加入 400μlTE 缓冲液溶解4.DNA 的提取：(1)超速离心后收集标记分界线以上溶液于透析袋中，4℃下，对水透析 3 次，每 60 分钟换水一次，然后对 TE 缓冲液透析过夜;(2)收集透析液约 16ml，加入 4ml5×蛋白酶 K 作用液，50℃水浴保温 12 小时;(3)冷却后，加等体积的饱和酚旋混均匀，离心(6000r/min，4℃，5 分钟)，取上清液重复用饱和酚抽提一次;(4)取上清液用等体积的氯仿-正丁醇抽提液抽提，离心同上，取上清液重复用氯仿-正丁醇抽提一次。

5)将上清液转移到浸入冰浴的烧杯(80ml)中，加等体积的异丙醇，慢慢转动使异丙醇和上清液混匀，出现白色纤维状物即为DNA6)用玻璃棒捞出 DNA，尽可能挤干，转移到微量离心管中，真空抽干，加入 400μlTE 缓冲液使 DNA 溶解，再加等体积异丙醇沉淀，-70℃下可长期保存KKME---专业医学搜索引擎 4℃，离心(10000r/min，20 分钟)，弃上清，真空抽干，用 400μlTE 缓冲液溶解三、结果和注意事项1.本法所得 DNA 和 RNA 样品，通过分别测定 OD260 值可计算其产量(按 10D260DNA=53μg/ml，10D260RNA=40μg/ml 计算)结果表明，1.0g 组织可同时得到 1.3mg 以上 DNA 和 400μg 以上RNA;450cm2 面积的培养细胞可同时得到约 400μgDNA 和300μgRNA2.本法制得的 DNA 纯度高，其 OD260/OD280 比值大于 1.8其琼脂糖凝胶电泳显示单一高分子量 DNA 带，无 RNA 酶污染，无DNA 降解现象3.本法制得的 RNA 纯度亦高，其 OD260/OD280 比值高于 1.8其琼脂糖变性凝胶电泳显示除了可见 28S 和 18SRNA 区带外，有时可见 5SRNA 带，在这些区带之间广泛分布着不同种类和 S 值的RNA 染色区，但着色强度比 28S 和 18SRNA 为小。

制品无 DNA 污染现象4.本法所有试剂及所有操作应避免 RNA 酶污染，鉴于此，操作者应戴一次性手套以防汗液中之 RNA 污染试剂及不宜高温烘烤的器皿应用 0.1%DEPC 处理过夜后高压消毒，尤其是 5.7mol/LCsCl 缓冲液和 TE 缓冲液，由于它们与样品中 RNA 接触时间最长，更要保证无 RNA 酶污染注意含 Tris 的试剂不能用 DEPC 处理，因 DEPC在 Tris 溶液中很不稳定，易分解生成乙醇和 CO2KKME---专业医学搜索引擎 DNA 和 RNA 过程中每次沉淀和溶解一定要彻底特别是超速离心所得 RNA 的溶解，应在 60℃下保温 30 分钟以促进其溶解，否则可能出现大量丢失6.同时收集超速离心后同一样品的标记分界线上下两部分上清液，分别提取其中 DNA，发现标记分界线以下的上清液中 DNA 的含量少且多为小分子量 DNA 片段，高分子量 DNA 主要存在于标记分界线以上的上清液中7.本法 DNA 的沉淀及保存均用 50%异丙醇而不用 70%乙醇，其原因在于前者沉淀的 DNA 更易于溶解，而且离心液体体积也小，但是异丙醇较乙醇不易挥发，应真空下抽干以彻底除净异丙醇。