通过OsmiR156对OsSPL14的调控确定水稻的理想的株型.doc

通过OsmiR156 对OsSPL14 的调控确定水稻的理想的株型提高作物产量是现代农业的一个重大挑战 新的植物品种，又被称为培育理想株型（IPA）,已经被提议用来作为一种手段，通过它提高现有高产品种水稻的产量 潜力在这里，我们报告的克隆和数量性状位点半控制， IPA1 （理想株型1），其中水稻株型有了令人满意的改变，并且大幅度提高了水稻的产量IPA1的数量性状位点 编码OsSPL14（SOUAMOS启动子结合蛋白 一LIKE14）并且由小RNA（miRNA在体内调 节的我们研究了关于OsSPL14扰乱OsmiR156（直接调节OsSPL14位点的突变体， 培育了一个分蘖数减少，增强抗倒伏能力并且提高粮食产量的一个 ’理想'水稻品种，我们的研究表明，OsSPL14可能有助于通过减轻培育新的优良的大米品种的困难来提 高水稻产量理想水稻品种对于粮食产量非常重要，并且取决于株高，分蘖数和分蘖角度， 穗的形态理想株型（IPA）的重要特点包括低分蘖数且有较少的无效分蘖， 每穗比目前种植品种有更多的籽粒，粗而结实的茎然而，对于形成理想珠型的分子机制和增 加潜在产量（的机制）还待进一步探讨，以及应用基因来改善水稻的植株形态是非常 有限的。

不同的水稻品种具有截然不同的植株形态，因此具有不同的潜在产量相对 于目前栽培稻品种，包括籼稻品种，印度品种Taichung Native 1 （台农一号），粳稻 边界植物少蘖粳（SNJ的植物构型体现了理想株型的的原则， 包括株高，分蘖数和穗形态（图1A）回交杂种SNJ,如台农一号或Hui7 （一粳稻）实验表明株高，分蘖数 和穗形态在回交后代不分离，这意味着与台农一号或 Hui7和SNJ在株型（IPA）差异可能是由单一基因控制的因此，我们指定 SNJ的形态作为IPA1 （理想株型1） •遗 传分析表明，IPA1是不完全显性的，规定显性杂合植株（OsSPL14IPA1/ipa1）介于纯 合植株 OsSPL14IPA1/IPA1 和 OsSPL14ipa1/ipa1 （补充图 1）为了方便的评价表型，我们选择分蘖数作为（理想株型）IPA1的决定特征利 用由SNJ和TN1回交后代形成的110株B2F2植株品种，我们发现了最大的数量性状 位点（QTL定位效应，这解释了 qTn8分蘖数有29.9 %的变动（的原因）qTn8被确 定在8号长臂染色体上的RM149和RM1345标记（位点）之间（图1b, c）,这是最有 可能和以前报道的确定水稻分蘖数的 3, 4的QTL一样。

为了克隆以IPA1位点基因， 5500株拥有与TN1相同分蘖数的BC2F2植株通过发达的分子标记技术确认了表型和基 因型（补充表1）我们缩小了包含IPA1位点（范围）----在M4和M5之间约78 kb （图1天）， 其中包含12个预测基因或ORF（开放阅读框）（图1e和补充表2,见网址）在SNJ 中的12个基因序列分析表明只有第三个外显子基因 OsSPL14 （LOC_OsO8g3989O; RAPID OsO8gO5O96OO的—个点突变被比作是大米多样性 （的原因）这个核苷酸的替换将 导致在SNJ中由亮氨酸变为异亮氨酸（图1楼及辅助图此外，Ri22，粳稻系表 现出类似SNJ的特性，还发现在OsSPL14周边相同的突变，而没有在台农一号，93-11 或中华11水稻品种发现此突变位点我们发现OsSPL14的表达水平由点突变影响（补 充图3）为了确定是否OsSPL1绷起IPA1的QTL（数量性状位点），我们通过培育的 转基因植物表达不同水平的 OsSPL14在 Nipponbare和Ri22系，粳稻系适合做基因转 化确认测试我们导入了携带 OsSPL14S因（指定的gOsSPL14的质粒，其中携带有 7.2 kb的基因组DNA片段，在Nipponbare中（见网上方法）。

gOsSPL14转基因系的减 少了分蘖，增强茎秆和穗分支和增加粮食产量（补充图相比之下，在R22中OSSPL14 的RNA干扰（RNA）的转基因植物的产生更多的分蘖并且株高，茎秆直径，穗分行和 穗粒数都显著的减少（补充图因此，我们认为OSSPL14是理想株型主要基因SPL的基因都有一个高度保守的DNA--结合域（SBP域），代表着一种特定的 属，明确的转录因子包括控制开花时间调控的参与，表型转变，叶分化和其他高等植 物发育进程5 -18在水稻基因组，有19个SPL基因和OsSPL1（也称为IPA1和WFP 是和拟南芥SPL9最相似的（参考文献8）（补充图6），也表明（他们）参与调节（第 一个叶原基的形成与第二个叶原基的形成之间的）间隔期的长度和叶子尺寸15，18 OsSPL14定位于细胞核（图1g），和转录因子的作用是一致的RNA的原位杂交显示， OsSPL14是主要在茎尖的生长（图2a）和生殖（图2b）的阶段表达它也在植物的初级和次生枝高度表达（图2c的）以往研究表明，11个OsSPL基因一般认定是OsmiR156的作用目标（参见8）, 一个miRNA有19到25个单链碱基对组成的非编码的 RNAs19家族成员公认的目标。

生物信息学分析表明，OsSPL14有OsmiR156在编码区域的互补基因（补充图要 确定OsSPL14是否可通过OsmiR156在体内调节，我们利用RNA连接酶映射介导的快速 的扩增OsSPL14OsmiR156旨定位点cDNA末端（RLM- RACE技术随机选择14个克 隆测序结果显示，有13个无性系5'端在目标站点的OsmiR156中部地区的裂解片段， 表明OsSPL14可以精确切割在体内 OsmiR156（图.2d ）在不同的水稻组织中OsSPL14和OsmiR156的表达模式显示实时PCR和miRNA的印迹分析表明，OsSPL14高度的在茎和茎尖表达，这与OsmiR156在体内的表达模式 互补（图2e，f ）一般的，OsmiR156的过度表达导致OsSPL14的转录大幅下降（补 充图，7a），而中断OsmiR156的表达（过度的MIM156的表达）会导致OsSPL14勺转录 有显著的增加（补充图，7b）这些结果表明，OsSPL14是由OsmiR156调节的，并在 体内指导定向分裂小分子RNAS过在植物体内转录分裂和在动物体内主要通过转录阻止来调节 目的基因起到重要作用最近的研究还表明，在更高等的植物中通过 miRNA的翻译抑制目标（基因）普遍存在。

要确定的分子机制，通过OsSPL14在体内被OsmiR156调节， 我们使用RT -PCR测定杂合子（OsSPL14IPA1形式ipa1 ）植物产物裂解位点附近的 序列，并发现完整的mRNA勺存在主要是OsSPL14ipa1 （图3A）为了证实这一点，我 们进一步测序了 37个来自于RT - PCR产物的克隆，并且发现33个克隆存在 OsSPL14ipa1这些结果表明，在SNJ中的OsSPL14的点突变扰乱阻止了通过OsmiR156 的OsSPL14的转录我们培育携带OsSPL14IPA7m绿色荧光蛋白转基因的转基因植物，其中有 7 个与OsmiR156不匹配位点，但没有引起任何氨基的变化 （图3b）该OsSPL14IPA7m GFP转基因植株表型与 OsSPL14ipa1 -GFP植株非常相似，它们都拥有比 OsSPL14IPA1-GF植株更加不好（severe）的表型，表明对于OsSPL1妣乱OsmiR156断 裂即使没有改变导致氨基酸序列，而导致 SNJ植株表型的变化为了研究点突变是否 扰动miRN—抑制OsSPL14的转录，我们用质粒 OsSPL14ipa1 （gOsSPL14ipa1）和 OsSPL14IPA1（gOsSPL14IPA1在转基因植物中测量 OsSPL14蛋白水平。

我们发现， gOsSPL14ipa1 - 1 转基因植株的蛋白水平当与 gOsSPL14IPA1-2 和 gOsSPL14IPA1-3 相比都有显着提高，虽然在 gOsSPL14ipa1 -1中mRNA水平比在gOsSPL14IPA1 -3 低（图3c, d ），表明，在大米中OsmiR156中的点突变一与OsSPL14互补位点扰乱 OsmiR156--指导转录停止和转录抑制为了评估OSSPL14潜力的应用来（选择）最有效的稻米形态并且最终提高水 稻产量，我们在Hui7遗传背景培育了一个近等基因系（NIL）它包含OsSPL14ipa1的 等位基因近等基因系（NIL） OsSPL14ipa1植株结果显示与近等基因系（NILO OSSPL14IPA1植株有转录和蛋白的积累的增加（附表， 8）相对于近等基因系OsSPL14IPA1植株，OsSPL14ipa1植株更高（图4a和图补充图，9a），并且分蘖少（图 4a和补充图，9b）,密穗（图4B）及强壮的秆（图4c和补充图，9C）深入研究这些 特性表征显示，在近等基因系OsSPL14ipa1植株中减少分蘖数是由于（第一个叶原基的 形成与第二个叶原基的形成之间的）间隔期的时间长。

补充图，10a）跨节的茎秆横 截面显示近等基因系（NIL） OsSPL14ipa1植株比近等基因系 OsSPL14IPA植株拥有更 多的维管束和更多的厚壁组织细胞（图 4d和补充图，10b）一般，近等基因系 OsSPL14ipa1植株茎机械强度与 NIL OsSPL14IPA1植株相比明显增加（图，4e）更重 要的是，统计分析表明，近等基因系OsSPL14ipa1植株穗产生更多初生和次生分枝（图 4f，g）和更多的谷粒（图 4h）千粒重由NIL OsSPL14IPA1植株的27.2增加至NIL OsSPL14ipa1 植株的克（图 4i ）理论上，近等基因系（NIL） OsSPL14ipa1植株的粮食单穗产量平均增加到6.5克相对于近等基因系（NIL） OsSPL14IPA1的4.6克（图4j ）把OsSPL14ipa1等 位基因导入到秀水11 （XS11, 一种粳稻品种在中国南方耕种，在测试区增加了大约 10%粮食产量（表1）这些结果表明，OsSPL14是一种多效基因，似乎赋予有少的不 育穗的理想水稻株型，提高每穗粮食产量和提升抗倒伏能力两者合计，我们的研究 结果表明，OSSPL14是水稻株型的一个重要的半显性调节器。

OSSPL14可能有助于促进基因工程和分子培育水稻品种使达到更高的潜在产量方法方法植物材料在粳稻背景SNJ和Ri22携带OsSPL14ipa1等位基因和有类似的植物结构与 在粳稻和籼稻系Hui7品种台农一号与Ri22和Ri22有不同株型从Hui7 x SNJF1代 植株回交4次生成Hui7发育成了了近等基因系Hui7 （NIL OsSPL14ipa1 ）为了培育 一个优良的拥有OsSPL14ipa1等位基因的水稻品种，从XS11 x SNJ的F1植株与XS11 回交三次生成BC3F1种从BC3F2代，NIL XS11OsSPL14ipa1被用来研究产量而培育构建了遗传转化为了构建gOsSPL14IPA质粒转化，一个7.2 kb的DNA片段含有1117 bp的上游序列，整个 OsSPL14IPA和 2326 bp的下游序列以及Nipponbare的基因组DNA用gIPA11F和gIPA11R做引物（补充表1）,然后用gIPA11F和glPA11R（补充表1） 到双元载体pCAMBIA130上植物来基因转化Kpnl-Xbal -勺消化片断被整合到二元载 体 AHLG上OsSPL14ipa1-GFP和 OsSPL14IPA17m-GF的突变体被通过引物 gipa11F, gipa11R 和 7mIPA1GFP1F, 7mlPA1GFP1R补充表 1）。

为了构造miRNA156O质粒，PCRT增片段扩增，从全长c。