pcr技术简介与检验.pdf

PCR技术的简介 孙涛 PCR技术简史 PCR的基本原理 PCR检验 PCR技术简史 发展史发展史 PCR仪变迁仪变迁 Kary MullisKary Mullis 1985年10月25日，申请了PCR的专利， 1987年7月28日批准（专利号4683202）， 这次MULLIS是第一发明人； 1986年6月，CETUS公司纯化了第一种 高温菌DNA聚合酶，Taq DNA 聚合酶； 1988年，第一台PCR仪问世 PCR技术简史 发展史发展史 PCR仪变迁仪变迁 Kary B. Mullis 1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大 科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣 获1993年度诺贝尔化学奖 PCR仪的变迁仪的变迁 手动手动/机械手式水浴基因扩增机械手式水浴基因扩增 自动化控制型定性基因扩增仪自动化控制型定性基因扩增仪 终点定量终点定量/半定量扩增仪半定量扩增仪 实时定量扩增仪实时定量扩增仪 发展史发展史 PCR仪变迁仪变迁 72℃ 60s72℃ 60s 9494℃ 30s30s55℃ 45s55℃ 45s PCR循环循环 手动手动/ /机械手式水浴基因扩增机械手式水浴基因扩增 实时荧光定量实时荧光定量PCR仪仪 扩增时间为2小时 一次扩增数量96人 份 PCR的基本原理 PCRPCR反应条件反应条件 PCRPCR过程过程 PCRPCR的特点的特点 标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系 引物引物 酶酶 4 4种种dNTPdNTP混合物混合物 模板模板DNA DNA MgMg2+ 2+ 12345 22 55 72 94 时间（min） 温 度 （℃） 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA 变 性 形 成 2 条 单 链 子链延伸 DNA加倍 PCR的基本原理 PCRPCR反应条件反应条件 PCRPCR过程过程 PCRPCR的特点的特点 PCR的基本原理 •PCR反应条件 •PCR过程 •PCR的特点 12345 22 55 72 94 时间（min） 温 度 （℃） 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 子链延伸 DNA加倍 DNA 变 性 形 成 2 条 单 链 模板DNA 95℃ PCR的基本原理 •PCR反应条件 •PCR过程 •PCR的特点 50℃ 引物1 引物2 DNA引物 PCR的基本原理 •PCR反应条件 •PCR过程 •PCR的特点 引物1 引物2 DNA引物 72℃ Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 •PCR反应条件 •PCR过程 •PCR的特点 72℃ 第1轮结束 95℃ 第2轮开始 PCR的基本原理 •PCR反应条件 •PCR过程 •PCR的特点 95℃50℃72℃ Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 •PCR反应条件 •PCR过程 •PCR的特点 72℃ 第2轮结束 PCR的基本原理 •PCR反应条件 •PCR过程 •PCR的特点 模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增 第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5’3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3’5’ 解旋酶解链酶 DNA 解旋解链 合成引物 子链延长 实时荧光定量PCR原理 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5’3’ DNA 解旋解链 合成引物 子链延长 GGAUCG AUCGCG 5‘ TAGCGCTATCGCA 3’ DNA 聚合酶 报告荧光 淬灭剂 TAGCGCTATCGCA 实时荧光定量PCR原理 5‘ PCR的基本原理 PCRPCR反应条件反应条件 PCRPCR过程过程 PCRPCR的特点的特点 PCR检验 标本处理标本处理 污染处理污染处理 PCR的临床应用的临床应用 部位 时间 标本采集 PCR检验 标本处理标本处理 污染处理污染处理 PCR的临床应用的临床应用 标本运送与保存标本运送与保存 对于检验靶核酸为DNA的标本， 标本采集后建议8小时内在室温下运 送至实验室，若为RNA在应在4小时内 送至实验室。

所有临床标本在采集后 送至实验室前均应暂放在2-8 ℃临床 时保存临床标本血清或血浆在-20 ℃度后下可以保存3个月70℃可以 保存更长时间 PCR抑制物 内源性 外源性 PCR检验 标本处理标本处理 污染处理污染处理 PCR的临床应用的临床应用 产生污染 的原因 样品的交叉污染； 试剂间的污染； 产物的污染； 重组质粒的污染； 其它等 PCR检验 标本处理标本处理 污染处理污染处理 PCR的临床应用的临床应用 • 污染的监测 – 阳性对照； – 阴性对照； – 重复性试验； – 选择不同区域的引物时进行PCR扩增 PCR检验 标本处理标本处理 污染处理污染处理 PCR的临床应用的临床应用 • 防治污染的方法 –严格分区及遵守工作程序； –化学清污-稀酸处理法； –紫外照射法 PCR检验 标本处理标本处理 污染处理污染处理 PCR的临床应用的临床应用 • PCR技术应用-----生物学领域 – 基因、DNA片段的克隆； – 人工基因构建； – DNA序列测定 – 基因定点突变； – 遗传背景分析 – 生物物种鉴定，系统进化研究 PCR检验 标本处理标本处理 污染处理污染处理 PCR的临床应用的临床应用 • PCR技术应用----医学领域 – 疾病基因检验/遗传病的产前诊断； – 致病病原体的检测； – 肿瘤治疗中癌基因的检测，会推广到大部分疾 病治疗前的检测； – DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别、法医物 证； – 其它：动、植物检疫。

PCR检验 标本处理标本处理 污染处理污染处理 PCR的临床应用的临床应用 • 肝炎类 – 乙型肝炎DNA测定 – 丙型肝炎RNA测定 PCR检验 标本处理标本处理 污染处理污染处理 PCR的临床应用的临床应用 • 病原体DNA测定 – 人巨细胞病毒DNA测定 – EB病毒DNA测定 – 结核杆菌DNA测定 – 人乳头瘤病毒DNA测定 – 淋球菌DNA测定 – 沙眼衣原体DNA测定 – 解脲脲原体DNA测定 – 单纯疱疹病毒II型DNA测定 PCR检验 标本处理标本处理 污染处理污染处理 PCR的临床应用的临床应用 乙肝DNA测定 医嘱名称：医嘱名称： 乙型肝炎乙型肝炎DNA测定测定 英文缩写：英文缩写：HBV-DNA 检测方法：荧光定量检测方法：荧光定量PCR 标本类型：血清标本类型：血清、、血浆血浆、、乳汁乳汁 检测下限：检测下限：1××102IU/ml 丙肝RNA测定 标本送检：必须在抽血后标本送检：必须在抽血后2h内送检内送检，，否则否则 核糖核酸易降解核糖核酸易降解，，造成假阴性结果造成假阴性结果 医嘱名称：医嘱名称： 丙型肝炎丙型肝炎RNA测定测定 英文缩写：英文缩写：HCV-RNA 检测方法：荧光定量检测方法：荧光定量PCR 标本类型：血清标本类型：血清 检测下限：检测下限：5.0××102IU/ml 注 肺炎支原体DNA测定 医嘱名称：医嘱名称： 病原体病原体DNA测定测定（（肺炎支原体肺炎支原体）） 英文缩写：英文缩写：MP-DNA 检测方法：荧光定量检测方法：荧光定量PCR 标本类型：痰液标本类型：痰液、、咽拭子咽拭子 结果报告：阴性结果报告：阴性/阳性阳性（（ 5.0××102拷贝拷贝/ml ）） 结核杆菌DNA测定 医嘱名称：医嘱名称： 病原体病原体DNA测定测定（（结核杆菌结核杆菌）） 英文缩写：英文缩写：TB-DNA 检测方法：荧光定量检测方法：荧光定量PCR 标本类型：痰标本类型：痰、、血液血液、、脑脊液脑脊液、、宫颈拭子宫颈拭子、、 尿液尿液、、胸腹水胸腹水 结果报告：阴性结果报告：阴性/阳性阳性（（ 5.0××102拷贝拷贝/ml ）） 人巨细胞病毒DNA测定 医嘱名称：医嘱名称： 病原体病原体DNA测定测定（（人巨细胞病人巨细胞病 毒测定毒测定）） 英文缩写：英文缩写：HCMV-DNA 检测方法：荧光定量检测方法：荧光定量PCR 标本类型：血浆标本类型：血浆、、乳汁乳汁、、尿液尿液 检测下限：检测下限：5.0××102拷贝拷贝/ml 解脲脲原体DNA测定 医嘱名称：医嘱名称： 病原体病原体DNA测定测定（（解脲脲原体解脲脲原体 测定测定）） 英文缩写：英文缩写：UU-DNA 检测方法：荧光定量检测方法：荧光定量PCR 标本类型：泌尿生殖道分泌物棉拭子标本类型：泌尿生殖道分泌物棉拭子、、生生 殖道刮片殖道刮片、、组织活检标本组织活检标本 结果报告：阴性结果报告：阴性/阳性阳性（（5.0××102拷贝拷贝/ml ）） 沙眼衣原体DNA测定 医嘱名称：医嘱名称： 病原体病原体DNA测定测定（（沙眼衣原体沙眼衣原体 测定测定）） 英文缩写：英文缩写：CT-DNA 检测方法：荧光定量检测方法：荧光定量PCR 标本类型：泌尿生殖道分泌物棉拭子标本类型：泌尿生殖道分泌物棉拭子、、生生 殖道刮片殖道刮片、、组织活检标本组织活检标本 结果报告：阴性结果报告：阴性/阳性阳性（（5.0××102拷贝拷贝/ml ）） 淋球菌DNA测定 医嘱名称：医嘱名称： 病原体病原体DNA测定测定（（淋球菌测定淋球菌测定）） 英文缩写：英文缩写：NGH-DNA 检测方法：荧光定量检测方法：荧光定量PCR 标本类型：泌尿生殖道分泌物棉拭子标本类型：泌尿生殖道分泌物棉拭子、、生生 殖道刮片殖道刮片、、组织活检标本组织活检标本 结果报告：阴性结果报告：阴性/阳性阳性（（5.0××102拷贝拷贝/ml ）） EB病毒DNA测定 医嘱名称：医嘱名称： 病原体病原体DNA测定测定（（EB病毒测定病毒测定）） 英文缩写：英文缩写：EB-DNA 检测方法：荧光定量检测方法：荧光定量PCR 标本类型：全血标本类型：全血 结果报告：阴性结果报告：阴性/阳性阳性（（5.0××102拷贝拷贝/ml ）） 人乳头瘤病毒DNA测定 ♪ 高危型HPV（8个型）HR-HPV ♫低危型HPV（6/11型）HPV6/11 人乳头瘤病毒DNA测定 医嘱名称：医嘱名称：  病原体病原体DNA测定测定（（人乳头瘤病毒人乳头瘤病毒6/11型型）） 病原体病原体DNA测定测定（（人乳头瘤病毒人乳头瘤病毒8个型个型）） 检测方法：荧光定量检测方法：荧光定量PCR 标本类型：泌尿生殖道分泌物棉拭子标本类型：泌尿生殖道分泌物棉拭子、、生生 殖道刮片殖道刮片、、组织活检标本等组织活检标本等。

结果报告：阴性结果报告：阴性/阳性阳性 思考题： –标准的标准的PCRPCR反应体系包括哪些？反应体系包括哪些？ –PCRPCR反应的特点？反应的特点？ 。