细胞生物学实验-鸡血细胞的体外融合.pdf

鸡血细胞的体外融合鸡血细胞的体外融合鸡血细胞的体外融合鸡血细胞的体外融合实验目的：1.了解聚乙二醇（PEG）诱导体外细胞融合的基本原理 2.通过PEG诱导鸡血细胞融合实验，初步掌握细胞融合的基本方法实验原理：细胞融合是在自发或人工诱导（诱导剂或促融剂）下，两个或两个以上 的异源（种、属间）细胞或原生质体相互接触，发生膜融合、胞质融合和核 融合并形成杂种细胞的现象称为细胞融合基本过程包括细胞融合形成异核 体（heterokaryon）、异核体通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形成单核 杂种细胞 有性繁殖时发生的精卵结合是正常的细胞融合，即由两个配子融合形成 一个新的的二倍体体细胞融合可形成四倍体或多倍体细胞，最终形成杂种 细胞的特性会有很大变化细胞融合的历史：科学家很早就注意到了在自然条件下发生的细胞融合现象，最初是在病 理组织中发现了由细胞融合产生的多核细胞，紧接着发现在脊椎动物和无脊 椎动物的正常细胞中也有融合的细胞，随后在体外组织培养中也发现了离体 细胞的融合现象活病毒可在体内介导癌细胞融合的发现帮助科学家实现了 利用灭活病毒促进动物异种细胞的融合，从而打破了细胞融合的种属屏障， 推动细胞融合技术跃上新的台阶。

由于原生质体的大量制备较为困难，限制 了植物细胞融合技术的发展，因此植物细胞融合的起步较动物细胞融合要迟 10年左右直到用酶法大量制备有活力的原生质体获得成功后，才使植物原 生质体的融合工作迅速发展起来细胞融合的方法和手段始终朝操作方便、 简单，便于量化研究，同时融合率又能得到不断提高的方向发展鸡血细胞的体外融合鸡血细胞的体外融合应用领域（动物细胞）：1.用于基因定位和绘制人类基因图谱：根据杂种细胞中某一染色体或其片段的存 在与否和细胞的某一性状表达与否相联系，从而可以实现把基因定位于某一染 色体或某一区段上 2.用于生产树突状细胞抗肿瘤疫苗：一般认为肿瘤细胞表面抗原不能诱导强的免 疫应答反应，但是树突状细胞（Dendritic Cells, DCs）与肿瘤细胞融合形成的树 突状细胞疫苗能够有效地激发机体的细胞免疫应答，已经在动物研究和人体早 期临床试验中证明这是一种方便、安全、可行的方法 3.用于生产单克隆抗体：使小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合形成能产生单克隆抗体 （monoclonal antibody, mAb）的杂交瘤细胞，单克隆抗体具有专一性和灵敏性， 是重要的生命科学研究工具。

4.用于动物育种：体细胞核移植技术（Somatic Cell Nuclear Transfer Technique, SCNT）是将细胞核移植到另一细胞的细胞质中的生物技术动物体细胞融合后， 杂种细胞难以发育再生为一个个体，但借助于细胞核移植的方法将融合后杂种 细胞的细胞核移入去核成熟卵内，可培育新的杂种动物体 5.在基础理论研究方面：用于研究细胞的核质关系和个体发育；用于揭示疾病发 生的机制；用于膜蛋白动力学研究等鸡血细胞的体外融合鸡血细胞的体外融合应用领域（植物细胞）：植物细胞融合技术目前主要是作为扩大变异的手段，同时也正朝着将抗 药性和胞质雄性不育等细胞质基因导入另一个体细胞的方向发展，有可能形 成新的核质杂种如果获得了有用性状的细胞系，在还不能形成植株时，就 可以通过快速大量繁殖细胞加以利用 在生产应用研究方面，植物细胞融合在育种上有重要的应用价值，通过 诱导不同种间、属间甚至不同科间原生质体的融合，有可能打破有性杂交不 亲和的界限，广泛地组合各种基因型，从而形成有性杂交方法所无法获得的 新型杂种植株；另一方面可将各种细胞器、DNA、质粒、病毒、细菌等外 源遗传物质引入原生质体，从而引起细胞遗传性的改变，为某些珍稀植物的 快速繁殖、植物的复壮等提供了可行的方法，可以应用于植物育种、种质保 存、无性系的快速繁殖和有用物质生产等。

植物细胞融合配合常规育种技术，可望选出优良材料，加之体细胞杂交 来自双亲的遗传物质并非简单的堆积，而是发生了复杂的遗传重组，这正是 改良作物所期望的植物细胞融合的作用主要表现在：通过植物细胞融合培 育抗病新材料；合成新的物种；转移细胞质基因鸡血细胞的体外融合鸡血细胞的体外融合应用领域（微生物）：对微生物而言，细胞融合技术主要用于改良微生物菌种特性、提高目的 产物的产量、使菌种获得新的性状、合成新产物等与基因工程技术相结合， 使对遗传物质进一步修饰提供了各种各样的可能性目前，微生物细胞融合 的对象已扩展到酵母、霉菌、细菌、放线菌等多种微生物的种间以至属间， 不断培育出用于各种领域的新菌种鸡血细胞的体外融合鸡血细胞的体外融合细胞融合的方法：诱导细胞融合的方法有三种：生物方法（病毒）、化学方法（聚乙二醇 PEG）、物理方法（电脉冲和激光融合）某些病毒的被膜中有融合蛋白 （Fusion Protein），可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融 合，因此可以用灭活处理的此类病毒诱导细胞融合化学和物理方法可造成 膜脂分子排列的改变，去掉作用因素之后，质膜恢复原有的有序结构，在恢 复过程中便可诱导相接触的细胞发生融合。

病毒诱导融合：病毒是最早采用的融合剂常用于诱导动物细胞融合的 病毒有仙台病毒、新城鸡瘟病毒、疱疹病毒等，其中仙台病毒最常用用作 融合剂的病毒必须事先用紫外线或β-丙内酯灭活，使病毒的感染活性丧失而 保留病毒的融合活性 优点：融合率较高，对各种动物细胞都适宜，病毒繁殖快，容易培养； 缺点：不稳定，在保存过程中病毒的融合活性会降低，而且制备过程比 较烦琐，病毒还有可能会对细胞的生命活动产生干扰鸡血细胞的体外融合鸡血细胞的体外融合鸡血细胞的体外融合鸡血细胞的体外融合细胞融合的方法：聚乙二醇诱导融合：聚乙二醇具有强烈的吸水性以及凝聚和沉淀蛋白质 的作用，能够有效地促进植物原生质体和动物细胞的融合在不同种类的动 物细胞混合液中加入聚乙二醇，就会发生细胞凝集作用，在稀释和除去聚乙 二醇的过程中，就会发生细胞融合聚乙二醇诱导细胞融合的分子机理还不 太清楚作为化学试剂，聚乙二醇使用起来很方便，诱导细胞融合的频率比 较高，但是它有一定毒性，对有些细胞（如卵细胞等）不适用电融合：20世纪80年代建立起来的电融合技术，是将两种细胞的混合液 置于低压交流电场中，使细胞聚集成串珠状，然后施加高压电脉冲，以促使 细胞融合。

紧密排列的细胞在相互接触的细胞膜之间会出现无蛋白颗粒的脂 质区，当受到电击时，这个区域就会被击穿，产生脂双层膜孔，导致细胞之 间的细胞质连通，进而发生细胞融合电融合技术有许多优点，如诱导细胞 融合的频率高、操作简便、可重复性好，但是对细胞的杀伤比较大鸡血细胞的体外融合鸡血细胞的体外融合仙台病毒成纤维细胞鼠肿瘤细胞融合培养基融合形成杂种细胞在选择性培养 基中杂种细胞 增殖形成克隆杂种细胞异核体杂种细胞克隆植物细胞A植物细胞B去掉细胞壁原生质体A原生质体B原生质体融合再生细胞壁杂种细胞细胞分裂愈伤组织杂种植株实验器材：普通光学显微镜、剪刀、镊子、载玻片、盖玻片、注射器、滤纸、胶头吸管、 离心机、血细胞计数板、水浴锅、烧杯、容量瓶、酒精灯实验试剂：1. 0.85％NaCl溶液 2. GKN液：80.0 g NaCl、0.4 g KCl、1.77 g Na2HPO4·2H2O、2.0 g葡萄糖、0.69 g NaH2PO4·2H2O、0.01 g酚红，溶于1000 ml重蒸水中 3. 50％（m/v）PEG溶液：①取50.0 g PEG（相对分子质量= 4000）放入100 ml瓶中， 高压灭菌20 min；②让PEG冷却至50～60℃，勿让其凝固；③加入50 ml预热至50℃ GKN液，混匀后置37℃备用。

4. Hanks原液（10X）：NaCl 80.0g、Na2HPO4·12H2O 1.2g、KCl 4.0g、KH2PO40.6g、 MgSO4·7H2O 2.0g、葡萄糖 10.0g、CaCl21.4g 5.Hanks液：Hanks原液 100 ml、重蒸水 896 ml、0.5％酚红 4 ml，灭菌后4℃保存 6. 詹纳斯绿染液鸡血细胞的体外融合鸡血细胞的体外融合实验步骤：1．鸡血细胞的获得 从家鸡的翼根静脉用注射器采血，注入试管后，迅速加入肝素（100 U肝素/5 ml全血） 混合，制成抗凝全血 2．鸡血细胞储备液的制备 在抗凝全血的试管中，加入4倍体积的0.85％NaCl溶液，制成红细胞储备液，置于4℃ 冰箱内可供一周内使用 3．鸡血细胞悬液的制备 取鸡血细胞储备液1 ml，加入7 ml 0.85％NaCl溶液，混匀后，1200 rpm离心5 min，弃 去上清液，用7 ml 0.85％Nacl溶液重悬沉淀，再按上述条件离心一次最后弃去上清 液，加入3 ml的GKN溶液制成鸡血细胞悬液 4．稀释 取0.5 ml鸡血细胞悬液，加3.5 ml的GKN溶液进行稀释 5．鸡血细胞的收集和计数 吸取1 ml鸡血细胞悬液放入离心管中，加入4 ml Hanks液混匀，在血细胞计数板上计 数。

若细胞浓度过大，用Hanks溶液稀释至107个/ml左右1000 rpm离心5 min弃去 上清液，用1 ml Hanks溶液重悬沉淀，使沉淀的血细胞团块松散，在37℃水浴中静置 2 min 鸡血细胞的体外融合鸡血细胞的体外融合实验步骤：6．PEG诱导细胞融合 吸取1 ml 37℃的50％PEG溶液，慢慢沿着离心管壁逐滴加入，边加边轻摇离心管， 使PEG与细胞充分混匀，然后在37℃水浴中静置3 min 7．终止PEG作用 缓慢加入5 ml Hanks液，轻轻吹打混匀，37℃水浴中静置5 min 8．制备细胞悬液 用吸管轻轻吹打细胞团数次使细胞团分散，1000 rpm离心5 min，使细胞完全沉降 弃去上清液，加1 ml Hanks液，再离心一次，留200 μl上清后混匀 9．染色和镜检 吸取一滴细胞悬液滴在载玻片上，加入等量詹纳斯绿染液混匀，染色3 min后盖上盖 玻片，在显微镜下观察细胞融合情况（40 X） 10．计算细胞融合率 细胞融合率是指在显微镜的视野内，已发生融合的细胞其细胞核总数与该视野内所 有细胞（包括已融合细胞）的细胞核总数之比，通常以百分比表示，而且要进行多 个视野测定，进行统计分析。

鸡血细胞的体外融合鸡血细胞的体外融合1. 用70％乙醇清洗计数板表面（注意不要划伤半银的表面） 2. 清洗盖玻片，在边缘稍微沾一点水，然后将盖玻片压到计数板的凹槽和半银的计 数区域上，注意不要把水导入凹槽，这样会稀释细胞悬液 3. 用力吹打以分散所有的细胞团块，用移液器吸取20µl 的混合液（不要让移液器的 液面上移，以免造成液柱顶部的细胞丢失） 4. 将细胞悬液移到计数板小室的边缘，利用毛细作用使移液器中挤出的细胞悬液充 满计数板和盖玻片之间的空隙，小室内的液体以刚好流到计数板凹槽的边缘为准， 不能多也不能少，否则表面张力将会引起小室容积的变化 5. 选择10倍的物镜，利用网格线对焦，如果由于对比度太弱而使聚焦困难，可以调 节可变光阑减少入射光或者通过偏置聚光镜使光线略微倾斜以增加对比度 6. 移动计数板，使视野恰好是整个网格区域中心的一个大方格，计算四大格里的细 胞总数，压线细胞只计左侧和上方的如果观察到两个或两个以上细胞组成的细 胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细 胞悬液 7. 四个大格子的细胞总数除以4再乘以稀释倍数，最后乘以104 8. 计数板计数的最适浓度为5～10×105细胞 / ml，此范围外计数误差偏大。

高浓度 细胞悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数鸡血细胞的体外融合鸡血细胞的体外融合注意事项：1.高Ca2+浓度能够提高细胞融合率有些抗凝剂中含有和Ca2+结合的化合 物，导致血液中的Ca2+浓度降低，故起抗凝血作用，但是会降低细胞的 融合效率 2.用滴管小心吸取上清，可以留下0.5 ml的溶液以避免损失血细胞 3.必须严格。