分子生物学实验9000字.docx

    分子生物学实验9000字    实验一 RT-PCR法钓取小鼠肝脏GAPDH基因一、TRlzol试剂提取小鼠肝脏总RNATRIzol RNA提取试剂盒是由GIBCOBRL公司推出的产品，其操作方法简捷、方便，lh之内即可完成，所制备的RNA可用于cDNA合成及Northern blot等试剂】TRlZOL试剂氯仿异丙醇75％乙醇（DEPC水配制）无RNase水【操作方法】（1）收获细胞1~5×106；或50-100mg组织，加TRlzol试剂lml匀浆2），移入1.5ml Ep管中，室温静置5min3）每1ml TRIZOL中加氯仿0.2m1，摇振15s，置室温2～3min4）4℃离心，12,000g×15min5）仔细吸取上层水相，移至另一Ep管中6）加0.5ml异丙醇，混匀，置室温10min7）4℃离心，12,000g×10min8）弃上清，加75％乙醇1m1，轻轻摇振，充分洗涤沉淀，4℃离心，7500g×5min9）弃上清，真空干燥后，沉淀重悬于50μl无RNase水中一70℃保存备用二、核酸的定量（1）分光光度法测定核酸浓度组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收波长为250~270nm之间。

例如腺嘌呤的最大紫外线吸收值在260.5nm，胞嘧啶：267nm鸟嘌呤：276nM胸腺嘧啶：264.5 nm尿嘧啶259nm这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收峰不会改变，但核苷酸最大吸收波长是260nm，吸收低谷在230nm，这个物理特性为紫外分光光度法测定核酸溶液浓度提供了基础在波长260nm紫外线下，1OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50ug/ ml；单链DNA或RNA为40ug/ml；单链寡核苷酸为20ug/ml另外，还可以通过测定260nm和280nm的紫外线吸收值，然后根据其比值来估计核酸的纯度DNA样品的比值为1.8，RNA样品的比值为2.0若DNA样品的比值高于1.8，说明样品中含有RNA，RNA、DNA溶液中含有酚和蛋白质将导致比值降低紫外分光光度法只用于测定大于0.25ug/ml的核酸溶液DNA样品的浓度为：OD260×核酸稀释倍数× 50/1000（ug/ul）RNA样品的浓度为：OD260×核酸稀释倍数 ×40/1000（ug/ul）操作步骤：取适当体积（2ul）核酸样品，加水或（TE）至100ul，混匀将核酸定量仪调制RNA测定一项，输入稀释倍数，然后把样品放入核酸定量仪中读数。

核酸定量仪将直接给出样品浓度三、电泳检测（1） 0.25g 琼脂糖加入25ml 1×TAE电泳缓冲液中，摇匀在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解2） 冷却到60℃，加入1μl的0.5mg/ml EB，并摇匀3） 将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入，室温冷却凝固4） 将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子5） 用移液器吸取总RNA样品5μl于封口膜上，再加入1μl 的6Xloading buffer，混匀后，小心加入点样孔6） 打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min四、RT-PCR：采用promega RT Kit1. 逆转录反应：1）取1μg总RNA于一PCR管，70℃反应10min，轻轻离心后置于冰上2）建立20μl RT反应体系：MgCl2 4μl10×RT缓冲液 2μldNTP Mixture（10mM） 2μl（1.25mmol/L）RNase inhibitor 0.5μl逆转录酶 1μl（200U）Oligo(dT)15引物 1μl总RNA 1μg加无核酶水至总体积 20μl3）涡旋混匀，42℃反应15分钟，95℃加热5分钟，0-5℃5分钟。

2. PCR扩增：（GAPDH扩增产物1059bp）GAPDH primer: 5’-gcctcgtctcatagacaagatgg-3’（58-80）5’-ctcagtatccttgctgggctg-3’（1095-1115） 1058bp1) 建立PCR反应体系：上步逆转录反应得到的cDNA 5μl 5.0μM的GAPDH混合引物 2μl 10×PCR buffer 5μl 10mM dNTPs 1μl Taq DNA聚合酶 0.5μlMgCl2 4μl Total volume 50 μl2) 按下列程序运行循环：step1 95℃变性 4 min step2 95℃变性 45 sec step3 53℃复性 45 sec step4 72℃延伸 90 sec step5 72℃温育 10 min step6 4℃ 保存 24 hrsstep2-4运行30个循环，其中复性温度主要依据引物的不同而不同五、PCR产物4℃保存或琼脂糖凝胶电泳检测实验二 从琼脂糖凝胶中分离回收PCR产物(E．Z．N．A．Gel Extraction Kit)1. RT-PCR的产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，紫外灯下观察。

为防DNA损伤，避免长时间的紫外光照射2. 用刀片或凝胶尺切下含有所需DNA带的凝胶，置于1.5ml离心管中，称重3. 往离心管中加入胶重的等量体积的Binding Buffer（即每100mg胶加入100 ul Binding Buffer）.4. 50℃水浴10分钟，使凝胶完全熔解，在水浴过程中每2~3分钟漩涡震荡混匀一次5. 将离心柱放入2ml收集管中，将上一步熔解的凝胶导入离心柱中，10,000g离心1分钟6. 将离心柱重新放回收集管；加入300ul Binding Buffer，10,000g离心1分钟7. 弃去收集管中的液体，将柱子放回收集管，再加入700 ul SPW Wash Buffer，静置2-3分钟，10,000g离心1分钟8. 重复步骤7一次9. 弃去收集管中的液体，空柱放回收集管，再10,000g离心1分钟10. 将离心柱放入一个干净的1.5ml离心管，加入20~50ul去离子水到柱子内部中央，放置2分钟，离心1分钟11. 收集管中的溶液即为已纯化的GAPDH基因DNA片段实验三 GAPDH基因的TA克隆一、连接1. 在微型离心管中制备下述连接反应液，全量为10 μl：pGEM-T VectorGAPDH基因ligase2×ligase bufferTotal: 0.5 μl* 3 .5μl* 1.0 μl* 5.0 μl 10.0μl2. 室温连接2小时，或者16℃连接(过夜。

二、转化感受态细胞制备：下面介绍CaCl2方法制备大肠杆菌感受态细胞（以下均需无菌操作）：1. 以灭菌牙签从LB琼脂平板上挑取单个菌落，接种于装有3ml的LB培养基中2. 将接种的试管置空气摇床中，37℃强烈振荡（200转/分）6~8小时3. 从中吸取50μl的细菌培养物接种于另一装有3ml LB的试管中，37℃强烈振荡（200转/分）2小时左右，使培养物的光密度值（OD600）达到0.3~0.54. 将细菌培养物转移于1.5 ml灭菌离心管中，4℃离心，5000转/分，5分钟5. 吸去上清，加入750μl预冷的100mMCaCl2，轻轻吹匀6. 将离心管置冰浴中30分钟，然后4℃离心，5000转/分，5分钟7. 吸去上清，加入75μl预冷的100mMCaCl2，轻轻吹匀，置4℃储存备用8. 制备好的大肠杆菌感受态细胞可以在4℃保存24~48小时，在最初12~24小时内，转化效率增加3~5倍，然后降低至初始水平转化：1. 于超净台中取连接产物10μl与100μl大肠杆菌感受态细胞混合，置冰浴中30分钟2. 42℃热休克90秒，置冰浴中3-5分钟3. 于超净台中加LB培养基900μl，37℃水浴1小时。

4. 4000rpm离心3分钟，弃上清，取残余液体重悬细菌4. 取l上述混合物均匀涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上5. 37℃孵箱培养12~16小时，可见长出单菌落6. 挑选单菌落，使用PCR法确认T载体中插入片段的长度大小，或提质粒酶切、测序鉴定实验四 E.Z.N.A? Plasmid Miniprep Kit I质粒提取1. 挑选一个单菌落,37℃过夜培养14~16小时2. 取1.5~5ml 菌液，10,000g 离心1分钟3. 弃上清，加入250μl 溶液I/RNase，漩涡震荡重悬细胞4. 加入250μl溶液Ⅱ，轻柔上下颠倒旋转混匀4~6次，室温放置2分钟5. 加入350μl溶液Ⅲ，轻柔上下颠倒混匀得到白色沉淀6. 10,000g 离心10分钟7. 将上清转移到HiBindTM DNA柱上,置于2ml离心管上注意不要吸到沉淀8. 10,000g 离心1分钟，弃残液9. 用500μl HB buffer 洗柱，10,000g 离心1分钟，去残液10. 用700μl DNA wash buffer (乙醇稀释)洗柱，10,000g离心1分钟，去残液11. 用700μl DNA wash buffer第二次洗柱10,000g离心1分钟，去残液。

12. 空柱子10,000g离心1分钟13. 将HiBindTM DNA转移至一干净的1.5ml离心管，于膜中央加入50μl ddH2O或TE溶解质粒10,000g 离心1分钟收集质粒实验五 酶切鉴定，电泳检测一 酶切鉴定DNA 5.0μl（约1μg）10×EcoRI buffer 1.0μlEcoRI 0.5μl Total 10μlDNA 5.0μl（约1μg）10×buffer 4 1.0μl10×BSA 1.0μlApaI 0.5μl Total 10μl37°C酶切2h二 电泳检测（同PCR产物的电泳）脂质体转染实验与荧光素酶活性检测一、目的掌握将质粒等外源DNA导入真核细胞的方法，并掌握荧光素酶报告系统二、概述（一）单光子仪简介 单光子计数器方法利用弱光下光电倍增管输出电流信号自然离散的特征，采用脉冲高度甄别和数字计数技术将淹没在背景噪声中的弱光信号提取出来当弱光照射到光阴极时，每个入射光子以一定的概率(即量子效率)使光阴极发射一个电子这个光电子经倍增系统的倍增最后在阳极回路中形成一个电流脉冲，通过负载电阻形成一个电压脉冲，这个脉冲称为单光子脉冲而单光子计数技术可测得低至单个不重叠的光子能量脉冲，通过精密的鉴别手段进行工作，从而实现探测“单光子”级别微弱信号的目的。

单光子计数器中使用的光电倍增管其光谱响应应适合所用的工作波段二）报告基因（reporter gene）介绍所谓的报告基因,是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体该基因的表达与插入基因的表达有关作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：(1)已被克隆和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中本不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；(3)其表达产物能进行定量测定目前报告基因的种类有：萤光素酶（Luciferase。