肝组织蛋白提取.doc

1 1 肝组织蛋白的提取 准备物品：准备物品：PBSPBS （提前消毒，（提前消毒，4℃4℃过夜备用），平皿，眼科剪，小镊子，匀浆器，过夜备用），平皿，眼科剪，小镊子，匀浆器，枪头，枪头，EPEP 管（以上物品需高压消毒备用），冰盒（所有操作均在冰上）管（以上物品需高压消毒备用），冰盒（所有操作均在冰上）1）取出肝组织块于平皿中，加入 PBS 漂洗，切下约黄豆大小的肝组织放入手动匀浆器中，在冰上迅速碾磨直至呈现云雾状2）加入组织裂解液约 500μL（裂解液:PMSF=100:1），冰上作用 20~30min3）吸取组织液到已高压灭菌的 Ep 管中，4℃离心，12000rpm×15min4） 取出 EP 管放在冰盒内,仔细吸取上清，取 2μl 的上清用于蛋白浓度的测定5）剩余上清，按蛋白：5xbuffer=4:1 的比例加入 5xbuffer,煮沸 10min6）瞬时离心，放入-20℃冰箱冻存备用2 2 蛋白浓度测定蛋白浓度测定 1）蛋白标准液（用 BSA 配制）25mg/ml 储存液，稀释为 0.5mg/ml，稀释步骤：例：10μL 25mg/ml 的蛋白标准液＋90μL PBS 混合成 2.5mg/ml 蛋白标准液20μL 2.5mg/ml 的蛋白标准液＋80μL PBS 混合成 0.5mg/ml 蛋白标准液 2）需设置八个标准孔以绘出标准曲线，采用 BCA 试剂盒测出蛋白浓度，标准 孔设置及所加试剂量如下：添加量（添加量（μμL））试剂试剂①②③④⑤⑥⑦⑧ 蛋白标准液蛋白标准液 （（0.5mg/ml））01248121620 PBS20191816128403）配制 BCA 蛋白测定液，溶液 A：溶液 B=50：1 先混合均匀，至完全互溶备用 4）待测蛋白孔加：2μL 蛋白液+18μL PBS，每孔的体积均为 20μL 5）每孔加 180μL 配好的 BCA 蛋白测定液，使每孔总体积均为 200μL； 6）室温避光放置两个小时或 37℃放置 30min； 7）用酶标仪测出每孔的吸光度， （570nm） ，测三次； 8）用 excel 工具根据标准孔的数据作散点图，并做出直线及公式。

以标准孔的 浓度为 X 轴（分别为 0，0.0025，0.005，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05） ，以所测标准孔的吸光度为 Y 轴，绘制线性关系图，并取相关度（R2值）最高的公式 代入计算出需测的蛋白浓度，进而计算出做 Western 的每孔加样量=（所需上样 的蛋白量）/（蛋白浓度×100）μL。