生物制药导论.ppt

生物制药概论生物技术发展简史 现代生物技术简介 基因工程、酶工程、细胞工程和发酵工程 生物药物与基因工程药物 国家863计划的成就（生物领域）l生物领域三个主题六个重大项目十三个专题项目三个主题高产、优质、抗逆动植物新品种新型药物、疫苗和基因治疗蛋白质工程六个重大项目两系法杂交稻技术；抗虫棉花等转基因植物；生物技术药物；重大疾病相关基因的研究；恶性肿瘤等疾病的基因治疗;动物乳腺生物反应器十三个专题 101-01 转基因植物；101-02 分子标记技术在农作物育种中的应用101-03 农业重组微生物；101-04 植物生物技术的应用基础研究；101-05 动物生物技术；101-06 农用基因工程生物的中试开发；102-07 重组疫苗；102-08 基因工程药物；102-09 抗体工程；102-10 人类重大疾病基因分离、克隆、结构和功能研究；102-11 医药新技术、新方法研究；102-12 医药生物技术产品的中试开发；103-13 蛋白质工程 两系法杂交稻技术国际领先我国两系法杂交水稻的技术已经成熟，已进入快速发展阶段共育成实用不育系34个，广亲和系26个24个组合通过品种审定，并在南方各省大面积推广，累计种植5300万亩，增产稻谷25亿公斤以上。

超级杂交稻研究取得初步成果，受到党和国家领导人的高度重视动物乳腺生物反应器 构建成了具有我国自主知识产权的以牛SIcasein和牦牛BLG两种基因为基础的乳腺组织特异性表达载体；建立了显微注射、体细胞克隆、单精注射受精等多种转基因技术体系组建了4个受体动物专用场基因工程疫苗和药物进入市场已有18种（其中3种拥有自主知识产权的I类新药）医药生物技术产品投放市场，世界上销售额前十位的生物技术药物，我国已生产8种并投放市场；另有9种药物已完成或正在进行临床试验、9种进入中试和18种处于实验室研究阶段，其中大部分具有自主知识产权；基因工程药物和疫苗的研制已初步实现了由跟踪仿制向创新的转变，以及从实验室研究向产业化的转化治疗性乙型肝炎疫苗初露端倪血源乙肝表面抗原-抗体二重复合物作为治疗性疫苗已获特殊临床试验批文，基因工程乙肝表面抗原-抗体二重复合物已完成实验室研究和中试工艺研究，正在申请临床试验另外，新开展的乙肝表面抗原-抗体-DNA疫苗三重复合物的研究，以小鼠为模型的实验结果证明疗效优于二重复合物，成果也已获中国和国际的专利人工血液代用品技术成功转让在完成实验室研究和小试后，又建成中试规模的血源生产基地，现已有连续6批的产品达企业质控标准。

研究的工艺路线具有自主知识产权，已申请3项国内发明专利；其技术转让费达1.6亿元人民币，创我国生物技术单项技术转让费最高纪录进化论和细胞学说l1859年，英国的生物学家CharlesDarwin发表了物种起源l1930s，德国植物学家MatthiasSchleiden和动物学家TheoderSchwann将对细胞的观察研究进行了理论的概括，共同创立了生物科学的理论基础细胞学说从1857年到1864年的8年，奥地利修道士Mendel选择了7种差异明显的简单性状,对豌豆的生长进行了仔细的观察，得出了遗传的分离规律和自由组合律1915年美国著遗传学家Morgan和他的助手们的杰出工作，第一次将代表某一特定性状的基因，同某一特定的染色体联系了起来，创立了遗传的染色体理论Morgan特别指出：种质必须由某些独立的要素组成，我们把这些要素称为遗传因子，或者更简单地称为基因经典遗传学分子生物学 l在1928年英国科学家F.Griffith就发现了肺炎双球菌的转化现象Avery与ColinMacleod及MaclynMccarry在此基础上继续对肺炎链球菌进行研究，证明使细菌性状发生转化的因子是DNA,而不是蛋白质。

DNA双螺旋的发现l1953年4月在英国Nature杂志上美国遗传学家JamesD.Watson和英国物理学家FrancisH.C.Crick共同阐明了DNA双螺旋立体结构模型DNA的半保留复制l随后又提出了DNA复制假说:在DNA复制过程中，双螺旋DNA的两条链相分离，并分别以每条DNA链作为模板，利用细胞中的脱氧核糖核苷酸，按照碱基互补的原则合成另一条子链DNA，从而形成结构完全相同的两个DNA双螺旋分子l1958年MatthewMeselson和FranklinStahl研究了经15N标记3个世代的大肠杆菌DNA，首次证明了DNA的半保留复制遗传密码 l用数学方法推算，如果采用每3个相邻碱基为一个氨基酸密码子，那么四种碱基组成的核苷酸能编出64组密码子，可以满足20种氨基酸编码的需要在M.Nirenberg,S.Ochoa和H.G.Khorana以及其他人的共同努力下，到1966年，所有的64种密码子都被破译了,如:AUG为起始密码;UAG,UAA和UGA为终止密码氨基酸序列比较60 ADGYARINGM SALVTTFGVG ELSALNAIAG AYSEFVPIVH IVGQPHTKSQ KDGMLLHHTL58 ADGYARIKGM SCIITTFGVG ELSALNGIAG SYAEHVGVLH VVGVPSISAQ AKQLLLHHTL57 AEGYARAKGA AAAVVTYSVG ALSAFDAIGG AYAENLPVIL ISGAPNNNDH AAGHVLHHAL 120 GNGDFNVFTR MSADISCTLG CLNSTHEVAT LIDNAIRECW IRSRPVYISL PTDMVTKKIE118 GNGDFTVFHR MSANISETTA MITDIATAPA EIDRCIRTTY VTQRPVYLGL PANLVDLNVP117 GKTDYHYQLE MAKNITAAAE AIYTPEEAPA KIDHVIKTAL REKKPVYLEI ACNIASMPCA180 GER-LDTPLD LSLPPNDPEK EDYVVDVVLK YLHAAKKPVI LVDACAIRHR VLDEVHEFVE 178 AKL-LQTPID MSLKPNDAES EKEVIDTILA LVKDAKNPVI LADACCSRHD VKAETKKLID177 APG-PASAL FNDEASDEAS LNAAVEETLK FIANRDKVAV LVGSKLRAAG AEEAAVKFAD239 KSGLPTFVAP MGKGAVDETH KNYGGVYAGT GSNPGVREQV ESSDLILSIG AIKSDFNTTG237 LTQFPAFVTP MGKGSIDEQH PRYGGVYVGT LSKPEVKEAV ESADLILSVG ALLSDFNTGS235 ALGGAVATMA AAKSFFPEEN PHYIGTSWGE VSYPGVEKTM KEADAVIALA PVFNDYSTTG人类基因组计划lHGP草图绘制完成lHGP提出的背景lHGP的实施 lHGP研究内容 lHGP医药方面的意义l人类的财产，双刃剑l展望 HGP草图绘制完成l2000年6月26日，是人类历史上最值得纪念的一天，英国和美国几乎同时向全世界宣布他们已经完成了具有划时代意义的人类基因草图。

依靠基因技术，人类既可能攻克癌症、糖尿病、痴呆等重病，又可以解决诸如“减肥”这一类的小毛病HGP提出的背景lDNA测序方法越来越先进l电子计算的应用大大加快了测序过程l人类许多疾病是源于遗传的原因，使人们迫切要求了解人类基因的序列l1986年，诺贝尔奖获得者雷杜尔贝柯石在美国科学杂志上发表文章，正式提出测定人类基因组计划，引起了整个美国科技界的震动HGP的实施l1990年10月被誉为生命科学“阿波罗登月计划”的国际人类基因组计划首先在美国启动l英国、日本、法国、德国和中国科学家先后加盟l我国承担的1%人类基因组测序工作，从而在这一科学丰碑上自豪地刻下了中国人的名字HGP研究内容l结构基因组学：遗传图、物理图、测序等研究；l功能基因组学：包括以转录图为基础的功能制图(基因组表达图)l 比较基因组学：对不同进化阶段生物基因组的比较研究HGP医药方面的意义基因治疗基因制药l肿瘤治疗方面l神经退化性疾病治疗 l自身免疫性疾病治疗 基因芯片 基因工程的诞生 到了70年代中期，两项关键性技术问世之后，DNA的结构分析问题才从根本上得到解决这两项技术是：1.DNA分子的体外切割与连接技术；2.DNA分子的核酸序列分析技术。

基因工程及其主要的研究内容l所谓的基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原先没有这类分子的寄主细胞内，而能持续稳定地繁殖,并通过工程化为人类提供有用的产品及服务的技术在文献中常见的有遗传工程(geneticengineering)、基因工程(geneengineering)、基因操作(genemanipulation)、重组DNA技术(recombinantDNAtechnique)以及基因克隆(genecloning)、分子克隆(molecularcloning)等基因工程应的几个主要步骤 从复杂的生物有机体中，用酶切消化或PCR扩增等手段，分离出带有目的基因的DNA片段将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的载体分子上，得到重组DNA分子将重组DNA分子转移到适当的受体中，并与之一起增殖筛选出含有重组DNA分子的受体细胞克隆提取出已经得到扩增的目的基因将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，实现功能表达，产生出人类所需要的物质基因操作的主要工具和技术 1工具酶 凡在基因工程中应用的酶类统称为工具酶工具酶种类繁多，如限制酶、甲基化酶、Klenow聚合酶；T-DNA聚合酶、polyA聚合酶、T-DNA连接酶、末端脱氧核苷酸转移酶、T4-RNA转移酶、逆转录酶等。

核酸内切限制酶核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶至今已发现了上千种核酸内切限制酶，常用的有几十种限制酶除用于DNA重组外，亦用于构建新载体DNA分子杂交DNA序列分析制备DNA放射性探针及DNA碱基甲基化识别等DNA连接酶 1967年，世界上有数个实验室几乎同时发现了一种能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶(1igase)这种酶能催化DNA片段末端5-磷酰基与3-羟基形成磷酸二酯键，从而起到连接DNA分子的作用基因克隆载体能承载外源DNA片段(基因)带入受体细胞的传递者称之基因克隆载体(genecloningvector)基因克隆载体的特点具有能使外源DNA片段组入的克隆位点能携带外源DNA进入受体细胞，或游离在细胞质中进行自我复制，或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而复制必须具有选择标记(如Ampr、Cmpr、Kanr和lacZ)，在承载外源DNA的载体进入受体细胞后，以便筛选阳性克隆pET-41 Ek/LIC 和 pET-43.1 Ek/LICDNA的提取 （1）物理分离法（2）从基因组文库和cDNA文库分离目的基因（3）用PCR技术从基因组中扩增出目的基因PCR (Polymerase Chain Reaction) PCR是一种体外扩增DNA的方法。

通过以下三个步骤：DNA链的热变性(Denaturationstep)引物退火(Annealingstep)聚合酶作用下引物的延伸(Extensionstep) pET-22b-F26G表达载体的筛选M654321Fig.1016recombinantsdigestedwithXhaIM:MarkerFig.11PCRproductM:Marker通过单酶切确认质粒大小和PCR确认序列证明了F26G基因已重组至质粒pET-22b上目的基因与载体的连接大多数的内切限制酶都能够切割DNA分子，形成具有1-4个核苷酸的粘性末端用同一种限制酶切割含有目的基因的外源DNA和载体DNA，产生的DNA片段的粘性末端应。