（新编）核酸外切酶、内切酶、聚合酶、连接酶

核 酸 外 切 酶 （ exonuclease） 　核酸外切酶是一类能从多核苷酸链的一端开始按序催化水 解 3、 5-磷 酸 二 酯 键 ，降解核 苷 酸 的酶。其水解的最终产物是单个的核苷酸（DNA 为 dNTP，RNA 为 NTP） 。按作用的特性差异可以将其分为单链的核酸外切酶和双链的核酸外切酶。 单链的核酸外切酶包括大 肠 杆 菌 核酸外切酶Ⅰ（exoⅠ）和核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ） 。核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）能够从 5′-末 端 或 3′-末 端 呈单链状态的 DNA 分子上降解 DNA，产生出寡核苷酸短片段，而且是唯 一 不 需 要 Mg2+离 子 的 活 性 酶 ，是一种耐受性很强的核酸酶。核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）可以用来测定基因组 DNA 中一些特殊的间隔序列和编码序列的位置。它 只 切 割 末 端 有 单 链 突 出 的 DNA 分 子 。 　　双链的核酸外切酶包括大 肠 杆 菌 核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ） 、 λ 噬 菌 体 核酸外切酶（λexo）以及 T7 噬 菌 体 基因 6 核酸外切酶等。大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ（exo Ⅲ）具有多种催 化 功能，可以降解双链 DNA 分子中的许多类型的磷酸二酯键。其中主要的催化活性是催化双链 DNA 按 3′→ 5′的方向从 3′-OH 末 端 释 放 5′-单 核 苷 酸 。大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ）通过其 3′→5′ 外切酶活性使双链 DNA 分子产生出单链区，经过这种修饰的DNA 再配合使用 Klenow 酶，同时加进带放 射 性 同 位 素 的核苷酸，便可以制备特异性的放射性探针。 　　λ 噬菌体核酸外切酶（λexo）最初是从感染了 λ 噬菌体的大肠杆菌细胞中纯化出来的。这种酶催化双链 DNA 分子从 5′-P 末端进行逐步的水解释放出 5′-单核苷酸。但不能降解 5′-OH 末端。内切酶（incision enzyme）这是一类能从 DNA 分子中间水解磷 酸 二 酯 键 ,从而切断双链 DNA 的核酸水解酶。它们不同于一般的脱氧核糖核酸酶（DNase）,它们的切点大多很严格，要求专一的核苷酸顺序识别顺序内切酶主要分成三大类。第一类内 切 酶 能 识 别 专 一 的 核 苷 酸 顺 序 ， 并 在 识 别 点 附 近 的 一 些 核 苷 酸 上 切 割DNA 分 子 中 的 双 链 ， 但 是 切 割 的 核 苷 酸 顺 序 没 有 专 一 性 ， 是 随 机 的 。这类限制性内切酶在 DNA 重组技术或基因工程中没有多大用处，无法用于分析 DNA 结构或克隆基因。这类酶如 EcoB、EcoK 等。 　　第二类内 切 酶 能 识 别 专 一 的 核 苷 酸 顺 序 ， 并 在 该 顺 序 内 的 固 定 位 置 上 切 割 双 链 。 由于 这 类 限 制 性 内 切 酶 的 识 别 和 切 割 的 核 苷 酸 都 是 专 一 的 。 所 以 总 能 得 到 同 样 核 苷 酸 顺 序的 DNA 片 段 ， 并 能 构 建 来 自 不 同 基 因 组 的 DNA 片 段 ， 形 成 杂 合 DNA 分 子 。 因此，这种限制性内切酶是 DNA 重组技术中最常用的 工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是 4 个或 6 个核苷酸，少数也有识别 5 个核苷酸以及 7 个、9 个、10 个和 11 个核苷酸的。如果识别位置在 DNA 分子中分布是随机的，则识别 4 个核苷酸的限制性内切酶每隔 46（4096）个核苷酸就有一个切点。人的单倍体基因组据估计为 3×199 核苷酸，识别 4 个核苷酸的限制性内切酶的切点将有（3×109/2.5×102）约 107 个切点，也就是可被这种酶切成 107 片段，识别 6 个核苷酸的限制性内切酶也将有（3×109/4×103）约 106 个切点。第三类内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式。一是交 错 切 割 ，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。粘性末端的意义：（1）连接便利：不同的 DNA 双链，只要粘性末端碱基互补就可以连接，这比连接两个平齐末端容易的多；同一个 DNA 分子内连接，通过两个相同的粘性末端可以连接成环状分子。（2）5’末端标记：凸出的 5’末端可以用 DNA 多核苷酸激酶进行 32P 标记。凸出的 3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴(如 AAA 或 TTT 等）造成人工粘性末端（3）补平成平齐末端粘性末端可以用 DNA 聚合酶补平成平齐末端如 EcoRI 的识别顺序为： 　　↓ | 　 　5’……GAA | TTC……3’ 　　3’……CTT | AAG……5’ 　　| ↑ 　 　垂直虚线表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是 GAATTC 或 CTTAAG，这就是回文顺序（palindrome） 。实线剪头表示在双链上交错切割的位置，切割后生成 5’……G和 AATTC……3’、3’……CTTAA 和 G……5’二个 DNA 片段，各有一个单链末端，二条单链是互补的，可通过形成氢 键 而“粘合”。另 一 种 是 在 同 一 位 置 上 切 割 双 链 ， 产 生 平 头 末端 。例如 HaeⅢ的识别位置是： 　　↓ 　　5’……GG↓CC……3’ 　　3’……CC↓GG……’ 　　↑ 　　在箭头所指处切割，产生的两个 DNA 片段是： 　　5’……GG CC……3’ 　　和 　　3’……CC GG……5’ 　　有时候两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，差别只在于当识别顺序中有甲 基 化 的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。例如 HpaⅡ和MspⅠ的识别顺序都是 5’……GCGG……3’，如果其中有 5’-甲基胞嘧啶，则只有 HpaⅡ能够切割。这些有相同切点的酶称为同切酶或异源同工酶（isoschizomer） 。 　第三类内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序。它在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对则是任意的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度 DNA 片段，具有各种单链末端。这对于克隆基因或克隆 DNA 片段没有多大用处。DNA 聚合酶（DNA polymerase） DNA 聚合酶（DNA polymerase）是细胞复制 DNA 的重要作用酶。DNA 聚合酶 , 以DNA 为复制模板，从将 DNA 由5' 端点开始复制到3'端的酶。DNA 聚合酶的主要活性是催化 DNA 的合成（在具备模板、引物、dNTP 等的情况下）及其相辅的活性。DNA 聚合酶的共同特点是：（1）需要提供合成模板；（2）不能起始新的 DNA 链，必须要有引物提供 3'－OH；（ 3）合成的方向都是 5'→3' （4）除聚合 DNA 外还有其它功能。 功 能[1]聚合作用:在引物 RNA'-OH 末端，以 dNTP 为底物，按模板 DNA 上的指令由DNApolⅠ逐个将核苷酸加上去，就是 DNApolⅠ的聚合作用。酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与模板 DNA 配对时才有催化作用。dNTP 进入结合位点后，可能使酶的构象发生变化，促进 3'-OH 与 5'-PO4 结合生成磷酸二酯键。若是错误的核苷酸进入结合位点，则不能与模板配对，无法改变酶的构象而被 3'-5'外切酶活性位点所识别并切除之。 [2]3'→5'外切酶活性──校对作用:这种酶活性的主要功能是从 3'→5'方向识别和切除不配对的 DNA 生长链末端的核苷酸。当反应体系中没有反应底物 dNTP 时，由于没有聚合作用而出现暂时的游离现象，从而被 3'→5'外切酶活性所降解。如果提高反应体系的温度可以促进这种作用，这表明温度升高使 DNA 生长链 3'末端与模板发生分离的机会更多，因而降解作用加强。当向反应体系加入 dNTP，而且只加放与模板互补的上述核苷酸才会使这种外切酶活性受到抑制，并继续进行 DNA 的合成。由此推论， 3'→5' 外切酶活性的主要功能是校对作用，当加入的核苷酸与模板不互补而游离时则被 3'→5'外切酶切除，以便重新在这个位置上聚合对应的核苷酸。在某些 T4 噬菌体突变株中 DNA 复制的真实性降低，而易发生突变，从此突变株分离得到的 T4DNA 聚合酶的 3'→5' 外切酶活性很低。相反，另外一些具有抗突变能力的 T4 突变株中的 T4DNA 聚合酶的 3'→5'外切酶活性比野生型高得多，因此，其 DNA 复制真实性好，变异率低。可见， 3'→5' 外切酶活性对 DNA 复制真实性的维持是十分重要的。 　　[3]5'→3'外切酶活性──切除修复作用:5'→3'外切酶活性就是从 5'→3' 方向水解 DNA生长链前方的 DNA 链，主要产生 5'-脱氧核苷酸。这种酶活性只对 DNA 上配对部分(双链)磷酸二酯键有切割活力作用，方向是 5'→3'。每次能切除 10 个核苷酸，而且 DNA 的聚合作用能刺激 5'→3' 外切酶活力达 10 倍以上。因此，这种酶活性在 DNA 损伤的修复中可能起着重要作用。对冈崎片段 5'末端 RNA 引物的去除依赖此种外切酶活性。 　　[4]焦磷酸解作用:DNApolⅠ的这种活性可以催化 3'末端焦磷酸解 DNA 分子。这种作用就是无机焦磷酸分解 DNA 生长链，可以认为是 DNA 聚合作用的逆反应，而且这种水解DNA 链作用需要有模板 DNA 的存在。(dNMP)n+XPPi←(dNMP)n-x+X(dNPPP)→DNA [5]焦磷酸交换作用: 催化 dNTP 末端的 PPi 同无机焦磷酸的交换反应。反应式为32P32Pi+dNPPP←dNP32P32P+PPi→DNA 　　最后两种作用，都要求有较高浓度的 PPi，因此，在体内由于没有足够高的 PPi 而无重要意义。 　　DNApolⅠ的 DNA 聚合酶活性和 5'→3'外切酶活性协同作用，可以使 DNA 链上的切口向前推进，即没有新的 DNA 合成，只有核苷酸的交换。这种反应叫缺口平移(Nick translation)。当双链 DNA 上某个磷酸二酯键断裂产生切口时，DNApoI Ⅰ能从切口开始合成新的 NDA 链，同时切除原来的旧链。这样，从切口开始合成了一条与被取代的旧链完全相同的新链。如果新掺入的脱氧核苷酸三磷酸为 α-32P-dNTP，则重新合成的新链即为带有同位素标记的 DNA 分子，可以用作探针进行 分子杂交 实验。 大 肠 杆 菌 DNA 聚 合 酶1、 大 肠 杆 菌 DNA 聚 合 酶 Ⅰ (DNApolymeraseⅠ，DNApol Ⅰ)这是 1956 年由ArthurKornberg 首先发现的 DNA 聚合酶，又称 Kornber 酶。此酶研究得清楚而且代表了其他 DNA 聚合酶的基本特点。 　 　(1)理化性质：纯化的 DNApolⅠ由一条多肽链组成，约含 1000 个氨基酸残基，MW为 109KD。分 子 含 有 一 个 二 硫 键 和 一 个 -SH 基 。 通 过 二 个 酶 分 子 上 的 -SH 基 与 Hg2+结 合 产 生 二 聚 体 ， 仍 有 活 性 。 每 个 酶 分 子 中 含 有 一 个 Zn2+， 在 DNA 聚 合 反 应 起 着很 重 要 的 作 用 。 每个大肠杆菌细胞中含有约 400 个分子，每个分子每分钟在 37℃下能催化 667 个核苷酸掺入正在生长的 DNA 链。经过枯草杆菌蛋白酶处理后，酶分子分裂成两个片段，大片段分子量为 76KD，通常称为 Klenow 片 段 ，小片段的分子量为 34KD。此酶的模板专一性和底物专一性均较差，它可以用人工合成的 RNA 作为模板，也可以用核苷酸为底物。在无模板和引物时还可以从头合成同聚物或异聚物。 　DNAPolⅠ 在 空 间 结 构 上 近 似 球 体 ， 直 径 约