浙江工业大学生物化学实验论文——对啤酒酵母的蔗糖酶
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1、浙江工业大学生物与环境工程学院生物化学实验论文姓 名： 组 员： 学 号： 学 科： 食品科学与工程所在院系：生物与环境工程学院指导教师： 邱乐泉 2012 年 12 月 1 日填啤酒酵母蔗糖酶的提取、提纯及测定研究论文摘要：为了解酶的初步提取及纯化方法，并在此基础上掌握测定酶活力的原理和方法；用 量凯式定氮法测定蛋白质含量的原理和方法，定蛋白质的相对分子质量。除此之外，还要掌握高速离心机、层析法、紫外分光光度计、凯氏定氮仪、蒸馏装置、电泳等用法。这一系列实验需要实验预制作酵母的自溶，大约 3 天以后，酵母细胞壁破裂，胞液流出，经多次分别离心得到初提液 A、热提液 B 和乙醇提取液 C。利用 层析法洗脱乙醇提取液 C 得到洗脱液 D 并在 280测 D 的吸光值，用葡萄糖测验试纸定性进行酶活力测试，发现洗穿透峰得到的第 1、2管酶活力高，从第 3 管以后吸光值开始下降，且吸光值大的酶活力较大。得到4 种酶提取液样品以后，便可以制作葡萄糖标准曲线，进行定量酶活力测定，葡萄糖标准曲线是一条直线，根据曲线回归方程计算 4 个样品的总活力单位数和酶回收率，比较计算结果可以知道随着蔗糖酶的不断提
2、纯酶的总活力单位数和酶回收率都减少。随后用 用微量凯氏定氮法测定的结果进行比较，后者测出的总蛋白含量比前者大，并且知道随着酶的提纯，A、B、C 、样品的纯化系数升高，比活力升高，总酶活、总蛋白和蛋白回收率却在下降，其中 A 的蛋白质含量最高，D 的纯化程度最高。最后用 马斯亮蓝的染色、洗脱等步骤测量蛋白质分子和染料的迁移距离间接测定蔗糖酶的相对分子质量，得到 2 条蔗糖酶条带，计算的蔗糖酶相对分子质量。关键词：蔗糖酶；提取纯化；酶活力测定；量凯式定氮法；o on to of of ay be of of of In we of UV of to of , . to an of 80nm , to ,2 to to of it a of is a to to of of of ou as of of of by in of of A, B, C, D4 is on is D, of of of of 、C 称转化酶(可作用于 21,2 糖苷键, 将蔗糖水解为 萄糖和 糖1 。随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究还是其他研究，越来越需要纯度高的酶制剂。由于酶本身也是蛋白质，
3、因此酶分离提存的方法大体上与蛋白质纯化方法相同，一般来说，没有一种固定的方法，而往往根据你所要分离提纯酶的取材以及酶本身的物理化学及生物学性质来确定分离提纯方法。各种酶的纯化通常有五个阶段：材料的选择与预处理；细胞破碎；抽提；纯化；浓缩干燥及保存。2、实验原理、验原理酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶属于胞内酶，所以常将细胞壁破碎后进行提取。酶的生产方法有生物提取法、微生物发酵法及化学合成法，细胞破碎又有化学裂解法、低渗溶液法等，本法属于生物提取法、菌体自溶的方法。经破碎提取的蔗糖酶液再经热提取、乙醇沉淀提取，使蔗糖酶得到初步的提纯。剂新鲜的啤酒酵母（冰冻在冰箱内，由实验室从啤酒厂买来） ；醋酸钠（；甲苯（；4 醋酸；95%乙醇（ ； 冲液。称取 于 1500蒸馏水中，用 4 节 约为 230，用蒸馏水稀释到 2L，即为 0.5 冲液。 冲液：将 冲液稀释 10 倍即得。注：整个实验要注意避免高温，以防止酶失活。材锥形瓶 2501） ，501） ；量筒 101）251）;烧杯 100 1 ） ，1000 1） ；具塞试管 10 3） ；吸球、玻棒、滴管、纸；培养箱；恒温水浴箱；磁力搅拌器，搅拌子；高速冷冻离心机。作方法1 酵母的自溶 ：培养 60 小时2 初提取液 操作取上层液体记体积为 热提取液 B： 乙醇沉淀提取液 倒入 100烧杯中，将烧杯放入冰浴中边搅拌边缓慢滴加 98%的冰乙醇， 30继续搅拌 5心，平衡（用 50%的乙醇，对方加） ，用 冲液溶解烧杯中的固体，与离心管中固体一起再次离心，得 果表 2色状态 体积（分析评价A 棕黄色液体 大B 橙黄色液体 黄色液体 小 = = = = /(=析在这次试验中，数据为初始数据，实验结果的真实可靠是以后实验的保障。我们的数据在 A
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