蚯蚓MT基因克隆和原核表达及转拟南芥研究

河北大学硕士学位论文蚯蚓MT基因克隆和原核表达及转拟南芥研究姓名：刘兰芳申请学位级别：硕士专业：植物学指导教师：李继刚20100601摘 要 I 摘 要 金属硫蛋白（metallothionein，简称 MT）是一类低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白。其中半胱氨酸的含量高达 30%左右，且蛋白质结构中没有二硫键。广泛存在于原核生物、原生动物、酵母、植物和动物等多种生物体内。研究表明，MT 具有参与体内微量元素代谢、解除重金属的毒性、清除自由基、拮抗电离辐射、参与激素和发育调节及增强机体对各种不良环境的适应能力等多种生物学功能。因此，在农业、医药保健和环境保护等领域具有广阔的应用前景。 本研究采用 RT-PCR 技术首次从 CdCl2诱导后的赤子爱胜蚓（Eisenia foetida）中克隆到长度约为 240bp 的 MT 基因 cDNA 序列。将获得的 MT 基因片段与 Gruber 等人得到的序列进行比对，发现二者在核苷酸水平上相似性达 95.2%，在氨基酸水平上相似性达98.7%； 二者都含有21个半胱氨酸， 半胱氨酸残基存在于6个X-Cys-X、 3个Cys-X-Cys、3 个 X-Cys-Cys-X 和 1 个 X-Cys-Cys-Cys-X 结构中；且都不含芳香族氨基酸和组氨酸。这表明我们成功地从赤子爱胜蚓中克隆到 MT 基因。 为了研究蚯蚓 MT 重金属结合方面的功能，将蚯蚓 MT cDNA 分别插入到原核表达载体 pET-28a 和 pET-DsbA 中，构建成非融合表达载体 pET-28a-efMT 和融和表达载体pET-DsbA-efMT，并转化宿主菌 BL21（DE3）进行表达。结果非融合表达载体未见表达产物，融和表达载体可见 DsbA-efMT 融合蛋白的高效表达。随后我们又对表达蚯蚓 MT的重组菌进行了 Zn2+抗性分析，发现重组菌对 Zn2+的抗性较对照菌有了很大提高。 本研究还将蚯蚓 MT 基因构建到植物表达载体 pBI121 和 pPZP111 中， 构建成 CaMV 35S 启动子驱动的组成型表达载体 pBI-efMT 和 pPZP-efMT；通过三亲交配法将上述质粒载体分别转入根癌农杆菌 EHA105 和 LBA4404 中。PCR 和酶切鉴定结果表明，表达载体构建正确，且已成功导入根癌农杆菌中。用农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥，得到 T0 代种子。 关键词 蚯蚓 金属硫蛋白 克隆 载体构建 原核表达 金属离子耐受性 拟南芥 Abstract II Abstract Metallothioneins (MTs) are a family of low molecular weight, cysteine-rich, metal- binding proteins. The cysteine residues constitute nearly one-third of the amino acid residues and MTs contain no disulfide bonds. MTs are present in a wide variety of organisms ranging from prokaryotes, protozoa, plants, yeast, invertebrates and vertebrates. Many studies demonstrated MTs may be involved in regulation of metabolism of trace metals and protection against heavy metal toxicity and oxidative stress, clearance of free-radicals. MTs may also participate in the regulation of hormone and development process, enhance the ability to environmental adaptation to the adverse environment and so on. As a result, MTs have a promising prospect in agriculture, medical care and environmental protection. The 240bp-metallothionein cDNA fragments encoding the Eisenia foetida metallothionein was first amplified by RT-PCR from the Eisenia foetida induced by cadmium chloride. Sequence alignment revealed 95.2% nucleotide sequence homology between the MT sequence of the fragment and the sequence acquired by Gruber, and the identity of the two putative proteins reaches 98.7%. They both contained 21 cysteines, and the cysteines are distributed in six single cysteine residues, three Cys-X-Cys and Cys-X-Cys motifs, and one triple Cys motif. The MT contains no aromatic amino and histidine residues. These results showed that the metallothionein gene had been successfully cloned from Eisenia foetida. The MT gene was introduced to pBI121 and pPZP111 binary vector, generating the constitutive expression vector pBI-efMT and pPZP-efMT which contained CaMV 35S promoter, and then the pBI-efMT and pPZP-efMT were transferred into agrobacterium tumefaciens strains EHA105 and LBA4404 respectively through the assistant plasmid pRK2013/HB101 by tri-parental mating. Results of PCR amplification and restriction digestion showed that the metallothionein gene efMT was introduced into pBI121 and pPZP111, and the expression vector pBI-efMT and pPZP-efMT were transferred into agrobacterium successfully. Arabidopsis thaliana (Columbia ecotype) was transformed by floral dip method mediated by Agrobacterial and T0 seeds have been harvested. Keywords Earthworm Metallothionein Clone Vector construction Prokaryotic expression Metal ion tolerance Arabidopsis thaliana第 1 章 文献综述 1第 1 章 文献综述 1.1 金属硫蛋白简介 1.1.1 金属硫蛋白的定义及特点 金属硫蛋白（metallothionein，简称 MT）一般定义为：低分子量、富含半胱氨酸、与哺乳动物典型的 MT 具有类似性质的金属结合多肽。1957 年，Margoshes 和 Vallee 在研究重金属 Cd 的作用时，首次从马的肾脏中分离出来1。1960 年，Kägi 和 Vallee 将其提纯，并正式命名为金属硫蛋白。后来发现 MT 广泛存在于多种生物体内。 典型 MT 的特点如下2： 1. 分子量小（6-7KDa） ，一般只有 60-80 个氨基酸残基。 2. 两个富含疏基（-SH）的簇状结构域，分子内不形成二硫键。 3. 半胱氨酸含量高达 23-33%，排列顺序具有较强的保守性。 4. 金属螯合能力，一般每分子 MT 含有 7-12 个金属离子。 5. 结合金属后呈现空间四面体的立体构型，具备光谱学特征。如 Zn-MT 在 224nm 处有最大光吸收，Cd-MT 在 250nm 处，而 Cu-MT 在 270nm 处。 1.1.2 金属硫蛋白的结构 MT 分子具有多态性。不同的生物之间其分子量、金属含量、氨基酸组成等存在着差异，但其空间结构及功能却有一定的相似性。单体 MT 分子通常以一种僵硬的构象形式存在，具有十分强的抗热变性和抗蛋白酶消化的能力3。 MT 的三级结构呈哑铃状，前半部分为 -结构域，后半部分为 -结构域，两个结构域相对独立且都呈球状4。如图 1.1 所示： 图 1.1 哺乳动物 MT 结构模型5 Figure.1.1 General model structure of mammilian MT 河北大学理学硕士学位论文 2MT的两个结构域功能不同，-结构域含11个半胱氨酸残基，可结合4个Cd2+或Zn2+，或者结合5-6个Cu+；而-结构域含9个半胱氨酸残基，可结合3个Cd2+或Zn2+，或结合6个Cu+，故一个MT分子可结合7-12个金属离子。金属离子与MT结合的稳定性不同，依次为Hg2+>>Bi3+、Ag+、Cu+>>Cd2+>Pb2+>Zn2+>Co2+>Fe2+。研究发现，Cd首先与MT的-结构域结合，然后才与-结构域结合，而Cu和Zn则正好相反6；但两个结构域在结合金属的过程中存在协同效应。对MT空间结构的研究发现，天然MT分子既不含二硫键，也没有游离的巯基（-SH） ，而是呈现出独特的金属硫四面体络合结构。MT脱去金属后即为硫蛋白（thionein，apo-MT） 。Apo-MT高级结构为无序的结构，当结合金属离子后就会折叠成有序的结构7。 1.1.3 金属硫蛋白的主要功能 1.1.3.1 参与体内微量元素代谢和解除重金属的毒性 Cu 和 Zn 等金属是细胞正常生理活动所必需的微量金属元素，MT 可以与它们结合而充当它们的储存蛋白8。根据体内微量元素的情况，机体可以对各种微量元素进行储存、 运输和释放等调节活动。 将小鼠的 MT 基因敲除后， 发现其对 Zn2+的吸收能力降低，说明 MT 基因对体内 Zn2+的平衡可能起作用9。体外实验表明，Zn-MT 和 Cu-MT 对许多酶类和蛋白质具有激活作用10。 MT 的巯基（-SH）能强烈螯合重金属 Hg、Ag、Pb、Cd、As、Cu、Zn 和 Ni 等，其中螯合 Pb 的强度比 Zn 大 200 倍，而螯合 Cd 的强度又比 Pb 大 10 倍，并可将之排出体外，使它们无法毒害人体，同时对体内 Zn 等微量元素无影响11。Park 等人12对敲除MT 基因的小鼠研究发现，MT 对一些金属解毒能力的顺序为：Cd>Z