蛋白质酶工程课堂问题整理

1、蛋白质酶工程，课堂提问整理第一章1、酶：酶是生物体内进行新陈代谢不可缺少的受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。2、酶工程的研究主要分为三个部分：酶的生产，酶的改性，酶的应用氧化还原酶（阳址!加I瑟） 话移醜（如E股讎）3、蛋白类酶可以分为六大类，分别是 （如图）4、酶的命名有两种方法:系统名（包括所有底物的名称和反应类型）、 惯用名（只取一个较重要的底物名称和反应类型）水解酶（hydrolase）裂合酶（顧菠）判断：耳构酶、合成酶gyntt麟険）或连接酶（1）寡聚酶：由几个或多个亚基组成，亚基牢固地联在一起，单个 亚基没有催化活性。亚基之间以非共价键结合。（V）（2）酶活力指在一定条件下酶所催化的反应速度，反应速度越大，意味着酶活力越高。（X ）（3）青霉素酰化酶不但能催化青霉素侧链的水解作用，而且也能催化逆反应。（V）（4）不同细胞最适PH不同，细胞产酶的最适PH与生长最适PH往往有所不同，同一种细胞，生产不同酶的最 适PH不同。（V ）5、酶的必需基团包括：（如图）6、酶的专一性：指酶对底物及其催化反应的严格选择性。（可分为结构专一性和立体异构专一性）必壽基团r结合基团专

2、一性 活性部恆催化基团催化性维持酶的空间结构7、温度对酶的双重影响：温度升高，酶促反应速度升高；由于酶的本质是蛋白质，温度升高，可引起酶的变性， 从而反应速度降低。8、最适温度：酶促反应速度最快时的环境温度。9、最适PH:酶催化活性最大时的环境pH。10、酶促反应速度：在适宜的反应条件下，用单位时间内底物的消耗或产物的生成量来表示。11、酶活力测定的一般步骤：（P8 ）1.根据酶催化的专一性，选择适宜的底物，并配制成一定浓度的底物溶液。2. 根据酶的动力学性质，确定酶催化反应的温度、pH、底物浓度、激活剂浓度等反应条件。3. 在一定的条件下，将一定量的酶液和底物溶液混合均匀，适时记下反应开始的时间。4. 反应到一定的时间，取出适量的反应液，运用各种生化检测技术，测定产物的生成量或底物的减少量。PS:酶的活力的国际单位是IU12、酶工程：是酶的生产与应用的技术过程，主要任务是通过预先设计，经过人工操作，获得所需的酶，并通过各 种方法使酶充分发挥其催化功能。第二章1. 酶的生产方法：提取分离法，生物合成法，化学合成法2. 遗传密码子的特点：连续性，简并性，普遍性与特殊性3. 酶的生物合成法

3、根据使用的细胞不同分类：微生物发酵产酶，植物细胞培养产酶，动物细胞培养产酶4. 葡萄糖效应的概念：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用 乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”这一现象称葡萄糖效应。产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。5. 实验室中常用于表达蛋白质的微生物：细菌，酵母菌，放线菌，霉菌6. 培养基五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水7. 培养基：是人工配制的，用于细胞培养和发酵的各种营养物质的混合物。8温度对微生物的发酵产酶有何影响：1、影响酶的活性2、影响微生物细胞的生长3、影响发酵方向4、影响发 酵液的黏度5、溶氧和传氧速率、反应速率9溶氧速率略大于耗氧速率？（等于或稍高于）细胞对潯解氧的需求量卿胸的呼吸强度及细胞的液度有关。细胞处 于不同生长阶段，其淞度及呼吸强度各不相同7软梗耗氧孵有很大 差别。因此在不同的堀阶段要供给适量的淹解氧O左酹靭期匕细IS呼眼强度大，但萌体里少，供事不要丈參 跚胞生长旺岳期，呼吸强度犬，览fc里供睾V 1胡胞生怅平體期，萌体主长蛊度主噩取決于瀋氧，

4、因产酶高耀期，仍罢犬重供氧10. 细胞对溶解氧的需求（如图）11. 简述酶生物合成的四种模式，什么是酶最 理想的合成模式，为什么？通过分析比较细胞 生长与酶产生的关系，可以把酶生物合成的模 式分为4种类型。即同步合成型，延续合成型， 中期合成型和滞后合成型。（详见P53）在酶的 发酵生产中，为了提高产酶率和缩短发酵周 期，最理想的合成模式应是延续合成型。因为 属于延续合成型的酶，在发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞一开始生长就有酶产生，直至细胞生长进入平衡期以后，酶还可以继续合成一段较长 的时间。12. 影响酶生物合成的模式的主要因素是：（1） mRNA的稳定性；（2）培养基中阻遏物存在与否。补：13、利用微生物产酶的优点1、种类多，酶种丰富，易筛选突变株2、生长周期短3、培养基便宜，条件简单4、基因工程第三章1. 细胞破碎的方法1）机械破碎2）物理破碎3）化学破碎4）酶解破碎2. 酶的提取主要包括哪些方法提取方法提取对象盐溶液提取用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶碱溶液提取用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的

5、酶有机溶剂提取用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶3. 酶的分离纯化的主要方法，依据是（1）沉淀分离：通过改变某一条件或者添加某种物质，使酶在溶液中的溶解度降低，从溶液中析出沉淀，而与其 它溶质分离（2）离心分离：离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度 不同特性的物质分离的 技术过程（常速，高速。超速离心机）（3）过滤与膜分离：借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。 （4）层析分离：利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中 （5）电泳分离：根据各种蛋白质解离、电学性质上的差异，利用它们在电场中的迁移方向与迁移速度不同而进行 纯化的一类方法。（6）萃取分离：利用物质在水和有机溶剂的溶解度不同而分离。4什么是盐溶盐析 盐溶现象：大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加的现象。 盐析：盐浓度达到一定界限后，酶的溶解度随盐浓度的升高而降低5什么是等电点沉淀法，原理是什么原理：利用两性电解质在等电点时溶解度最低和不同的电解质具有不同的等电点的特性，通过调节溶液的PH

6、,使 酶或蛋白质沉淀析出，从而使酶和蛋白质分离的方法。（等电点时，两性电解质分子的静电荷为零，分子间的静电 斥力消除，使分子能聚集在一起而沉淀下来。）6离心方法主要包括哪些 差速离心：采用不同的离心速度和离心时间，分离大小和密度相差较大的颗粒。 密度梯度离心：不同物质按沉降速度的大小形成区带。介质为蔗糖、甘油。分离密度相近大小不同的样品，如蛋白。 等密度梯度：介质的梯度有适当陡度，最大密度大于样品的最大密度，样品各组分移动到与各自密度相同的位置。 介质为CsCl。常用于分离大小相近密度不同的样品，如核酸。7电泳 带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。（颗粒在电场中的移动速度主要决定于 其本身所带的净电荷量，同时受颗粒形状和颗粒大小的影响。此外，还受到电场强度、溶液pH值、离子强度及支 持体的特性等外界条件的影响。 ）8什么是蛋白质双向电泳 （自己查阅资料哦，根据个人笔记大概是说：双向电泳是二维的，先根据等电点原理水平分布，后根据分子量大小 垂直分布，所以双向就是水平和垂直两方向，这样可以使酶分离更加彻底）9. 为什么SDS凝胶不受蛋白质所带电荷及分子形状的影

7、响（P106）10膜过滤技术：借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的 技术。11. 根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同，过滤可以分为：粗虑，微滤，超滤，反渗透12. 层析技术 利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的（称为固定 相），另一个相则流过此固定相（称为流动相）并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。13. 反胶束： 又称反胶团，是表面活性剂分布于连续有机相中形成的纳米尺度的一种聚集体。（油包水）14. 超临界流体是什么，有哪些性质？是指物质的压力和温度同时超过其临界压力（Pc）和临界温度（Tc）时的流体。 性质：（1）密度接近于液体，这使它具有与液体溶剂相当的萃取能力。（2）黏度和扩散系数与气体相近似，而溶剂的低黏度和高扩散系数的性质是有利于传质的，具有很高的传质速度。（3）该流体随着温度与压力的连续变化，对物质的萃取具有选择性。15. 根据超临界萃取方法不同，分为 1、等压分离 2、等温分离 3、吸附分离16结晶三部曲第一步：形成过饱和溶液一一稍微越过饱和状态，处于介稳态，浓缩

8、、降温（少有升温）、调节pH至pI，可使溶 液趋于过饱和。第二步：形成晶核一一过饱和溶液在一定条件下可形成极微小的有序排列的固相物，成为后续晶体生长的核心，称 为晶核。振荡、搅拌、快速降温可促使过饱和溶液形成晶核，有时可投入少量“晶种”微粒。第三步：晶体生长一一溶质在晶核周边不断有序排列，晶体逐步长大。控制条件，如缓慢搅拌、适当升温使细小晶 体溶解，溶质到大晶体周围集结生长。17、等电点沉淀：利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过 调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离补：在固体酶制剂的生产过程中，为了提高酶的稳定性，便于保存、运输和使用，一般都必须进行干燥。常用的干 燥方法有：真空干燥/冷冻干燥/喷雾干燥/气流干燥/吸附干燥第四章1、什么是酶分子修饰？通过物理、化学或生物化学等方法直接使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性的技术过程。基团碎2、酶分子的修饰方法金属离子置换修饰，大分子结合修饰（共价/非共价）物理修怖侧链基团修饰肽链有限水解修饰氨基酸置换修饰酶分子的物理修饰3. 酶分子修饰的意义提高酶的活力、增强

9、酶的稳定性、降低或消除酶的抗原性、研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、 金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响4. 酶分子修饰的基本要求和条件酶的稳定性.酶活性中心的状况条件：修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时酶的活 力回收高。（1）pH与离子强度pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。（2）修饰反应的温度与时间严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应。（3）反应体系中酶与修饰剂的比例5. 酶修饰后的性质变化热稳定性：提高；抗原性：降低或消除各类失活因子的抵抗力：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提高其稳定性。 半衰期：一般在体内的半衰期得到有效延长。最适pH：大部分酶经化学修饰后，酶的最适pH发生了变化，Km的变化：大多数酶经修饰后，Vm没有明显变化，但有些酶经修饰后，Km值变大。6. 酶分子的定向进化：是模拟自然进化的过程，在体外进行基因的随机突变，建立突变基因文库，通过人工控制条 件的特殊环境。定向选择得到具有优良特性的酶的突变体的技术过程。7. 体外定向进化的意义理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化的基本先决条件。1、天然酶在生物体内存在的环境与商业用酶的实际应用环境不同。2、人们需要某些酶的进化性质与生物体内的生化反应无关，而只是与人们的商业需求有关，这种性质只能通 过体外进化来实现。8. 酶分子定向进化的方法主要包括易错P

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