非蛋白氮的定量检验

1、非蛋白氮的定量检验在非蛋白氮定量的检测方法中，比较常用的方法是硫酸铜沉淀法和氨基酸测定法。除此之外， 本文根据非蛋白氮的组成结构的不同，采用水解蒸馏法对样品中的非蛋白氮进行检验。一、硫酸铜沉淀法根据非蛋白氮的化学性质来看，大部分溶于水，一部分在常温下不溶水，但在沸水中溶 解。根据此种性质，可以先将样品煮沸，用硫酸铜将样品中的蛋白质沉淀下来，由于非蛋白 氮已经溶于水，故可用过滤方法将其与样品中的蛋白质分离。在过滤时，水的温度一定不能 太低，否则象双缩脲一类的物质会因为不溶于常温水而不能被过滤掉。用此种方法测定出的 蛋白质含量称为样品的真蛋白质。但实际上，此种方法有很大的局限性。如果非蛋白氮不溶 于沸水，或者将一般的非蛋白氮微囊化，此种方法测出的结果会与样品中的实际真蛋白有很 大的差异。二、氨基酸测定法为了真正能够判定样品中是否掺有非蛋白氮，需测定样品中的氨基酸含量。无论采用经 典的氨基酸自动分析仪分析（柱后衍生），还是采用比较快捷的 HPLC 分析（往前衍生）， 将所测定的氨基酸总量相加得到一个总氨基酸数值，然后将此数值乘以6.25为M,和用凯 氏定氮法测定的粗蛋白质N相比较，M至少为N

2、的85%（M可能略大于N）。如果低于此数 值，则可以判定该样品中掺有非蛋白氮。三、水解蒸馏法1、原理：非蛋白氮主要包括五类：尿素及其衍生物类、氨态氮类、铵类、肽类及其衍 生物、动物粪便及其它废弃物类。如果在原料中掺有氨态氮类、铵类和粪便比较容易判断（可 采用硫酸铜沉淀法加镜检），一般很少将肽类及其衍生物掺入其中，剩下比较难鉴别的就是 尿素及其衍生物。尿素和尿素衍生物经过强酸或强碱水解为氨盐或氨和其它的物质，在强碱 的条件下可以蒸馏出氨气，原料中的蛋白质经过水解成氨基酸盐，氨基酸盐在强碱条件下稳 定，从而可将非蛋白氮和真蛋白氮进行分离。2、仪器和设备：酒精喷灯，试管和其它常用的仪器。3、试剂与溶液：6mol/l的盐酸溶液和其它常用的试剂。4、测定方法：本文只列出用酸水解的方法。采集有代表性样品约100g，混匀后用四分 法缩分出209左右，将其粉碎，使其全部通过60目样品筛。精确称取0.3000g的样品，置 于容积为60ml的试管底部(注意样品勿沾在管壁上)，加入30ml 6mol/l的盐酸溶液，将 试管在距试管口 12cm处用喷灯加热并封口。将封好的试管置于干燥箱内，于110C下水 解2

3、4h。冷却后打开试管，将水解液过滤至100ml容量瓶中，用蒸馏水反复多次冲洗试管和 滤纸，然后定容至刻度。用10ml移液管移取10ml样液移入半微量式定氮仪的反应室中，加 入20ml 1：1的氢氧化钠溶液蒸馏10 min，余下的步骤按照测定粗蛋白的方法进行操作， 得出样品所消耗的盐酸的体积为V (ml)。同时作空白滴定可得消耗的盐酸的体积为V,设10 所称样品的质量为M (g)。5、非蛋白氮的粗蛋白质计算公式CP(%)=(V-V ) XCXO.14X6.25/M10非蛋白氮的概述和检测方法文章来源：饲料工业更新时间：2002-11-7点击数：食1230曾 俊 苏俊黎1 非蛋白氮的概述非蛋白氮大致可以分为以下几类，尿素及其衍生物类，如缩二脲、羟甲基尿素等；氨态氮类， 如液氨、氨水等；铵类，如硫酸铵、氯化铵等；肽类及其衍生物，包括氨基酸、酰胺、胺等； 动物粪便及其它废弃物类。以下是几种常见的非蛋白氮的介绍：1l 双缩脲又称缩二脲，是一种尿素缩合产品，其含氮量在35上，蛋白质当量为219。缩二脲难溶于水，一般的定量检验方法为紫红色配位化合物比色法（原理：鱼粉中的双缩脲经抽提后，在酒石酸钠的碱

4、 性溶液中与硫酸铜生成紫红色配位化合物，在550nm波长下比色从而测出其含量）。12 尿素是氮和二氧化碳在高温高压下化合而成。纯尿素的含氮量为 47，折合蛋白当量为29375。易潮解，易溶于水，一般的定量检验方法有二种：一种为二甲基氨基苯甲醛显色法；另一种为二嗪衍 生物显色法。但以上两种方法只能测定游离性尿素而不能测定其衍生物。13 尿素甲醛聚合物是由尿素和甲醛聚合而成，其含氮量为 38.89，折合蛋白当量为24306。该聚合物难溶于水。14 硫酸铵俗称肥田粉，其含氮量为 20左右，折合蛋白当量为 125。硫酸铵的工业品一般为白色或微带黄色的结晶，易溶于水，其分子式为（NH）SO。42415 异亚丁基二脲又名二脲异丁烷，简称IBDU，为尿素和异丁醛在催化剂的作用下综合反应生成。IBDU为一种子的白色粉末或颗粒，总含氮量为 3218，折合蛋白当量为 201.13，吸湿度远低于尿素。以上是比较常见的非蛋白氮物质。随着科技的发展，还会有越来越多的非蛋白氮物质被合成出来 从而使反刍动物所用的非蛋白氮使用广泛，而掺假者很容易将此物质掺入饲料原料中以提高原料的粗 蛋白质。2 非蛋白氮的检验2l 非

5、蛋白氮的定性检验在对原料样品的检测中，一般有定性检测和定量检测。在定性检测中，使用的比较多的为显微镜检，包括直接镜检、分层镜检（用四氯化碳或三氯甲烷分层）、反应剂镜检（用化学物质和样品中的 某些物质反应而在显微下区分）、染色镜检等。在使用的过程中，往往使用一项或多项镜检方法对样 品中的物质进行判定。对于非蛋白氮的检验，显微镜检是一种比较有效的方法。在对样品的检测中，一般使用的是生物 显微镜，其放大的倍数在36400倍之间，为了获得更好的显微效果，可以根据实际情况作出具体的 调整。以下是镜检使用过程中的一些技巧：2.1.1 直接镜检直接镜检一般所用的倍数比较小，通过对样品不同的物理特征，如颜色、透明度、表面组织、形 状等物理性状进行判定。特别的要与典型的样品进行比较，以便能够更好区分样品与杂质的不同。在 直接镜检中，用不同的滤光片有时可以起到比较明显的效果。虽然直接镜检比较方便和直观，但有时 对于样品中的物质很难区分时，可以用其它的检验方法。2.1.2 分层镜检将样品用四氯化碳进行脱脂和比重分离之后，样品与其它物质的区分会更加容易。对样品中的有 机物和无机物分层之后，需在常温下干燥后再进

6、行镜检。非蛋白氮一类的物质与原料的很多外观性质 很不一样，通过两者的特异性之间的观察，可以对样品中是否掺有非蛋白氮一类的物质作出一个大概 的判断。213 反应剂镜检用反应剂和样品进行反应，非蛋白氮一类的物质的化学性质和样品不一样，通过此种方法可以对 样品中的非蛋白氮进行鉴别。经过四氯化碳分层之后，再与反应剂反应是比较好的一种方法。而镜检 时在样品中加一滴或数滴浓硫酸，观察样品与浓硫酸反应的情况是一种比较直观的鉴别方法。因为无 论动物蛋白还是植物蛋白，其与浓硫酸的反应速度和产生的现象比较明显。2.1.4 染色镜检用染色剂对样品进行染色，使样品中的植物或动物细胞染成不同的颜色，而非蛋白氮一类的物质 则和样品的染色后的表现不同，通过此种方法使两者区分开来从而加以鉴别。以下是比较常用的染色方法：对植物细胞的染色方法：番红固绿染色法。取适量脱胎（视样品脂肪多少而定，可以用四氯化碳，也可以用丙酮，对于脂肪少的也可以不用脱脂）样品于烧杯中，用1%的番红水溶液浸泡l3h 水洗（去多余的染料）。将样品涂在玻片上，稍晾干。滴加0. 1%的固绿（溶剂用95%乙醇）。过15s 后滴加95%的乙醇，冲去多余固绿

7、染料。待乙醇稍挥发后，加甘油液（甘油：水= 1:1）浸润，加盖玻 片。用生物显微镜检查。染色结果：细胞核，木质化细胞壁呈鲜红色，纤维素细胞壁、细胞质呈绿色。 因为非蛋白氮没有细胞核、细胞质等结构，所以只要能够较好的掌握染色技巧，其对比效果比较明显。 当然，不能从染色效果判断其一定为非蛋白氮。对动物细胞的染色方法：苏木精曙红对染法。取适量的脱脂样品于烧杯中，加入埃利希苏木 精染色液浸泡35min，水洗数次（用5min左右）。将样品涂在玻片上，滴加氨水。34s后立即满 加水，洗1 min，稍晾一下，加0.2%曙红水溶液浸润3min，滴加95%的乙醇，洗去多余曙红染料。 再稍晾一下，加甘油浸润，加盖玻片，用生物显微镜观察。其染色的结果为：细胞核呈蓝色，细胞质 呈淡红色。通过此种方法染色，一般能够很容易的区分样品和非蛋白氮一类的物质。为了能够更清晰的在显微镜下区分样品与杂质，也可采用以下方法（对于检验鱼粉一类的物质比 较有效）：先用四氯化碳或三氯甲烷对样品分层，除去无机物，必要时再用丙酮进行脱脂，再取一定 量的样品置入蒸馏水中，搅拌，除去溶于水的物质，再用60目或80目的样品筛过滤，将样品放入

8、50 60C的烘箱中进行烘干（时间不能过长，以保持样品原来的状态），然后在显微镜下进行检验或再对 其进行处理后镜检。在显微镜检中，只能对非蛋白氮作初步判断。若要进一步的分析判断，还需进行定量分析检验。2.2 非蛋白氮的定量检验在非蛋白氮定量的检测方法中，比较常用的方法是硫酸铜沉淀法和氨基酸测定法。除此之外，本 文根据非蛋白氮的组成结构的不同，采用水解蒸馏法对样品中的非蛋白氮进行检验。2.2.1 硫酸铜沉淀法根据非蛋白氮的化学性质来看，大部分溶于水，一部分在常温下不溶水，但在沸水中溶解。根据 此种性质，可以先将样品煮沸，用硫酸铜将样品中的蛋白质沉淀下来，由于非蛋白氮已经溶于水，故可用过滤方法将其与样品中的蛋白质分离。在过滤时，水的温度一定不能太低，否则象双缩脲一类的 物质会因为不溶于常温水而不能被过滤掉。用此种方法测定出的蛋白质含量称为样品的真蛋白质。但 实际上，此种方法 有很大的局限性。如果非蛋白氮不溶于沸水，或者将一般的非蛋白氮微囊化，此 种方法测出的结果会与样品中的实际真蛋白有很大的差异。2.2.2 氨基酸测定法为了真正能够判定样品中是否掺有非蛋白氮，需测定样品中的氨基酸含量。无论

9、采用经典的氨 基酸自动分析仪分析（柱后衍生），还是采用比较快捷的HPLC分析（往前衍生），将所测定的氨基酸 总量相加得到一个总氨基酸数值，然后将此数值乘以6.25为M,和用凯氏定氮法测定的粗蛋白质N相 比较，M至少为N的85%（M可能略大于N）。如果低于此数值，则可以判定该样品中掺有非蛋白氮。2.2.3 水解蒸馏法原理非蛋白氮主要包括以下五类：尿素及其衍生物类、氨态氮类、铵类、肽类及其衍生物、动 物粪便及其它废弃物类。如果在原料中掺有氨态氮类、铵类和粪便比较容易判断（可采用硫酸铜沉淀 法加镜检），一般很少将肽类及其衍生物掺入其中，剩下比较难鉴别的就是尿素及其衍生物。尿素和 尿素衍生物经过强酸或强碱水解为氨盐或氨和其它的物质，在强碱的条件下可以蒸馏出氨气，原料中 的蛋白质经过水解成氨基酸盐，氨基酸盐在强碱条件下稳定，从而可将非蛋白氮和真蛋白氮进行分离。 仪器和设备：酒精喷灯，试管和其它常用的仪器。试剂与溶液：6mol /I的盐酸溶液和其它常用的试剂。 测定方法：本文只列出用酸水解的方法。采集有代表性样品约100g，混匀后用四分法缩分出209左右，将其粉碎，使其全部通过60目样 品筛。精确称取0.300 0g的样品，置于容积为60ml的试管底部（注意样品勿沾在管壁上），加入 30ml 6mol / l的盐酸溶液，将试管在距试管口 l2cm处用喷灯加热并封口。将封好的试管置于干燥 箱内，于110C下水解24h。冷却后打开试管，将水解液过滤至100ml容量瓶中，用蒸馏水反复多次冲 洗试管和滤纸，然后定容至刻度。用10ml移液管移取10ml样液移入半微量式定氮仪的反应室中，加 入20ml 1:1的氢氧化钠溶液蒸馏10 min，余下的步骤按照测定粗蛋白的方法进行操作，得出样品所 消耗的盐酸的体积为V （ml）。同时作空白滴定可得消耗的盐酸的体积为V，设所称样品的质量为Mg）。非蛋白氮的粗蛋白质计算公式:CP(%)=(V-V ) X

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