干扰素在动物疫病防治和治疗中的应用效果介绍(1)

主讲人：柳增善 教授 日 期：2022年11月20日 干扰素研究背景 ☞研究背景 : 受到当前环境因素和其他方面的影响，一些动物疫病在形成的过程 中会与其他因素结合，使得病情恶化而且复杂，这样的情况加大了动物 疫病治疗的难度。病毒病没有更好的预防和治疗措施，特别是发生后只 能是减缓、降低危害，而不能彻底解决。相对来说，干扰素缓冲作用优 于其它方法。而且过多的动物用药物可能会在动物体内有残留，这会造 成食品安全问题。干扰素是通过动员机体强大杀伤外源病原和调节免疫 力，具有较强的功能，且对机体没有太多的损伤，在抗病毒方面，优于 其它措施。 求实创新 立志图强 　　　　　 ☞什么是干扰素: 干扰素是一类在同种细胞上具有抗病毒活性的糖蛋白，通过抑制病毒 DNA和RNA的复制达到预防和治疗效果。1957年自Isaacs和 Lindenmann发现干扰素以来，干扰素已经显示出了极强的抗病毒、 免疫调节活性和广阔的应用前景。因而，干扰素的研究越来越受到人 们的广泛关注。与传统的保健治疗药物相比，干扰素在治疗效果及使 用时机方面显示出了极大的优越性。 求实创新 立志图强 　　　　　 ☞ 干扰素的分类: 根据来源分为两大类型 1、传统型干扰素： 一般情况下该类型的产品运用后不会形成其他的物质，只是单 纯地限制体内一些病毒。一般指组织提取方式获得。表达完善 活性好，分子量小，快速排出。 2、基因工程干扰素： 在使用后会通过一些变化形成其他的单体。在具体运用的过程 中应该结合实际情况和需求选择相应的产品。如聚乙二醇，会 加大分子量，在血液中持续时间加长—长效干扰素。 工业污水 生活污水 求实创新 立志图强 　　　　　 ☞ 干扰素的分类: 工业污水 生活污水 求实创新 立志图强 　　　　　 ☞ 基因工程干扰素: 基因工程干扰素是采用基因工程技术将动物体内天然 干扰素基因亚克隆入原核表达载体，继而转入受体细胞， 构建工程菌。通过工程菌发酵表达，分离纯化等步骤最终 获得的高纯度干扰素产品。主要优势在于可控制的大量生 产。鉴定干扰素的公认标准是： 1、是一种蛋白质，但不是巨球蛋白。 2、抗病毒作用不是由于对病毒的非特异性毒性所致， 而是通过细胞内RNA和蛋白质的途径来完成的。 3、有广谱的抗病毒活性。 工业污水 生活污水 求实创新 立志图强 　　　　　 ☞基因工程干扰素的制备过程 工业污水 生活污水 求实创新 立志图强 　　　　　 ☞ 基因工程干扰素制备过程: 1、基因扩增及序列分析：根据已发表物种干扰素序列，设 计扩增引物，如引物序列为：F：5’ATGATCTACGAAT TCCACACCGCCTCC3’ ；R ：5’CAAGTCTGTCGACATA GCAGTTGCAGC3’。提取mRNA，进行RT-PCR扩增，将目 的产物回收后，连接至pMD-18T载体，测定序列，与已发 表序列进行分析。 工业污水 生活污水 求实创新 立志图强 　　　　　 ☞ 基因工程干扰素制备过程: 求实创新 立志图强 　　　　　 ☞ 基因工程干扰素制备过程: 2、重组Bacmid质粒构建与鉴定 将干扰素完整开放阅读框克隆至pFastbac1载体，鉴定 后，转化DH10Bac感受肽细胞，在三种抗生素的压力筛选 下，获得整合干扰素完整开放阅读框的重组Bacmid质粒。 工业污水 生活污水 求实创新 立志图强 　　　　　 工业污水 ☞ 基因工程干扰素制备过程: 3、重组杆状病毒的获得提取高质量的重组Bacmid质 粒，在脂质体介导下转染sf9细胞，盲传3代后，提取病毒 DNA，利用M13引物进行PCR鉴定，M13上游引物5’-CG CCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’，下游引物5’-AGC GGATAACAATTTCACACAGGA-3’。 4、重组蛋白鉴定将重组病毒感染sf9细胞，收集感染细胞进 行IFA分析，鉴定重组蛋白的表达。 生活污水 求实创新 立志图强 　　　　　 ☞ 基因工程干扰素制备过程: 5、重组IFN抗病毒活性分析利用水 泡性口炎病毒(VSV)－鸭胚成纤维 细胞分析重组IFN的抗病毒活性， 确定重组IFN的抗病毒活性单位。 工业污水 求实创新 立志图强 　　　　　 ☞ 基因工程干扰素制备过程: 6、菌种活化 1.将化冻后的菌种按1%（3ML/300ML）接种 量接种于灭菌的（高压灭菌、20min）的LB 培养基中。 2.将接种后的摇瓶置于培养箱中（160rp m),过夜培养。 工业污水 生活污水 求实创新 立志图强 　　　　　 ☞ 基因工程干扰素制备过程: 7、增殖培养 将活化后的菌液按3%的接种量（9ML/300ML）接种于灭菌后的L B培养基中，置于培养箱中（160rpm)培养3h至对数生长期。 8、诱导培养 将培养3h后的摇瓶从培养箱中取出，加入IPTG（30ul/300ML） 进行诱导培养，并重新将摇瓶送入培养箱中培养20h。 工业污水 生活污水 求实创新 立志图强 　　　　　 工业污水 ☞ 基因工程干扰素制备过程: 9、超声破碎 1.加入菌体湿重40倍的生理盐水，置于培养箱内重悬。 2.重悬后的菌液置于超声细胞粉碎机中进行超声粉碎，可 得干扰素原液。原液置于4度保存。条件：设置条件功率 为20%，工作2S，休息3S，持续25min. 10、干扰素保存 按增殖培养菌液的80%用生理盐水重悬，保存。 生活污水 求实创新 立志图强 　　　　　 病毒的进入细胞、转录、RNA定植、翻译、病毒成熟、装配及 释放等多个环节，均可能成为IFN的作用靶点。 工业污水 生活污水 求实创新 立志图强 　　　　　 求实创新 立志图强 　　　　　 ☞基因工程干扰素的优点 : 工业污水 生活污水 求实创新 立志图强 　　　　　 ☞ 基因工程干扰素的优点: 1、具有良好的治疗效果，在干扰素注入动物体内后会发生明显的治疗反应，能够对动物起 到较好的免疫作用，防止病毒在体内快速扩散，而且还能够对一些疾病起到良好的预防和治 疗作用。干扰素（IFN）是一种多功能的细胞因子，具有抗病毒、抗细胞增殖和免疫调节的 作用。干扰素具有广谱抗病毒作用，可抗DNA和RNA病毒。发挥药效快，2-4d即可起作用 2、副作用比较小，在动物疾病的预防和治疗过程中，大多数药物会对动物形成一定的负面 效果，而且一些药物还会残留在动物体内，这会对动物造成一定的影响，如动物的内脏会受 到较大的影响，甚至还会受损，而干扰素不会对动物造成影响。 工业污水 生活污水 求实创新 立志图强 　　　　　 ☞ 基因工程干扰素的优点: 3、物种特异性 工业污水 求实创新 立志图强 　　　　　 干扰素在畜禽病毒性疾病治疗中的应用 在抗病毒作用下，干扰素可以提升TB淋巴细胞，激活自然条件下的细胞 活性，促进体液免疫特异与非特异性形成免疫保护效果，虽然不能直接激活免 疫细胞，但能间接避免病毒复制，快速降低病毒细胞，通过信号转导等生化反 应激活基因生成抗病毒蛋白，提高动物或畜禽的自身免疫能力，进而达到抗病 毒的目的。 干扰素具有极强的抗菌作用，IFN-γ的作用机制是通过转铁蛋白受体，减 少细菌供铁量或通过诱导产生内源性NO，对细胞中细菌生长起到抑制作用， 同时还可以增加单核巨噬细胞吞噬小体使溶酶体溶解细菌，通过化学和生物反 应，共同起到灭菌作用。 IFN-γ通过诱导生成NO和酶催化作用，增强巨噬细胞活力，重组免疫系统， 抑制病原体接种，并刺激中性粒细胞增强其吞噬作用，达到抗寄生虫的效果。 工业污水 生活污水 求实创新 立志图强 　　　　　 ☞干扰素在动物疫病中的具体应用 工业污水 生活污水 求实创新 立志图强 　　　　　 ☞ 基因工程干扰素在禽类养殖中的应用: 临床上对病毒性疾病没有很好的治疗措施和方法，而干扰素具有广谱抗病 毒活性，同时，对机体免疫力、抵抗力增强明显，效果明显起到预防和抗病毒 作用，且副作用小，不易产生耐药性，使用方便，受到拥护的普遍欢迎。 由于干扰素具有强大的抗病毒作用，目前有许多研究报道用于治疗家禽病 毒性疾病。大量研究结果表明，重组鸡干扰素α在用于防治鸡禽流感、传染性 法氏囊炎、传染性支气管炎等病毒性疾病时，具有显著的抗病毒效果。 工业污水 生活污水 求实创新 立志图强 　　　　　 ☞ 禽干扰素的基因构成: atgtgcaacc acctgcgtcc gcaggacgcg accttctctc acgactctct gcagctgctg cgtgacatgg cgccgaccct gccgcagctg tgcccgcagc acaacgcgtc ttgctctttc aacgacacca tcctggacac ctctaacacc tcaggcgg acaaaaccac ccacgacatc ctgcagcacc gttcaaaat cctgtcttct ccgtctaccc cggcgcactg gaacgactct cagcgtcagt ctctgctgaa ccgtatccac cgttacaccc agcacctgga gactcttctg acacccgttc tcgtacccgt tggccgcgta acctgcacct accatcaaa aaacacttct cttgcctgca caccttcctg caggacaacg actactctgc gtgcgcgtgg gaacacgttc tctgcaggc gcgtgcgtgg ttcctgcaca tccacaacct accggtaac acccgtacct ag 492 工业污水 生活污水 求实创新 立志图强 　　　　　 ☞ 禽干扰素的临床分析: 求实创新 立志图强 　　　　　 ☞ 禽干扰素的临床分析: 求实创新