酶促反应动力学实验.doc

酶动力学综合实验实验（一）实验（一）————碱性磷酸酶碱性磷酸酶 KmKm 值的测定值的测定【目的要求】 1.了解底物浓度对酶促反应速度的影响 2.了解米氏方程、Km 值的物理意义及双倒数作图求 Km 值的方法 【实验原理】 1、碱性磷酸酶： 碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多其次为肾脏、 骨骼、肠和胎盘等组织但它不是单一的酶，而是一组同功酶本实验用的碱 性磷酸酶是从大肠杆菌中提取的 2、米氏方程： Michaelis-Menten 在研究底物浓度与酶促反应速度的定量关系时，导出了酶促 反应动力学的基本公式，即：(1)式中：v 表示酶促反应速度，表示酶促反应最大速度，[S]表示底物浓度，表示米氏常数3、 值的测定主要采用图解法，有以下四种：①双曲线作图法（图 1-1，a）根据公式（1） ，以 v 对[s]作图，此时 1/2时的底物浓度[s]值即为 Km 值，以克分子浓度（M）表示这种方法实际上很少采用，因为在实验条件下的底物浓度很难使酶达到饱和实测一个近似值，因而 1/2不精确此外由于 v 对[S]的关系呈双曲线，实验数据要求较多，且不易绘制② Lineweaver- Burk 作图法双倒数作图法（图 1-1，b）实际工作中，常将米氏方程（式（1） ）作数学变换，使之成为直线形式，测定 要方便、精确得多。

其中之一即取（1）式的倒数，变换为 Lineweaver- Burk 方 程式：(2)以 对作图，即为 y=ax+b 形式此时斜率为，纵截距为把直线外推与横轴相交，其截距相交，其截距即为—③Hofstee 作图法（略）把（2）式等号两边乘以，得：(3)以 v 对作图，这时斜率为，纵截距为，横截距为④Hanas 作图法（略）把（2）式等号两边乘以[S],得：(4)以对[s]作图，这时斜率为，纵截距为a） (b) 本实验主要以双倒数法，即 Lineweaver- Burk 作图法来测定碱性磷酸酶 Km 值 具体原理如下： 本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物，碱性磷酸酶能分解磷酸 苯二钠产生酚和磷酸，在适宜条件下（PH10.0，和 60℃） ，准确反应 13 分钟在碱性条件下酚可与酚试剂生成蓝色化合物，以波长 620nm 比色在一定条件 下色泽深浅与光密度成正比反应式如下：然后以光密度直接表示不同底物浓度时的酶反应速度，即以光密度的倒数作纵 坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按 Lineweaver- Burk 作图法来测定碱性磷酸 酶 Km 值。

【仪器与试剂】 仪器： 1. 恒温水浴 2. 721 型分光光度计 试剂：1． 酚试剂：称钨酸钠（W·2O）100g，钼酸钠（Mo·2O）25g 置 1500mL 磨口回流装置内，加蒸馏水 700mL，85%磷酸 50mL 和浓硫酸 100mL充分混匀，使其溶解小火加热，回流 10h（烧瓶内加小玻璃珠数 颗，以防溶液溢出） ，再加入硫酸锂（LiSO4）150g，蒸馏水 50mL 及液溴数 滴在通风橱中开口煮沸 15min，以除去多余的溴冷却后定容至 1000mL，过滤即成，此液应为鲜黄色，不带任何绿色置棕瓶中，可在冰 箱长期保存若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸几 分钟，恢复原色仍可继续使用使用时用蒸馏水稀释一倍，最后酸度为 1N2． 2.5mM 磷酸苯二钠基质液：称取 625mg 磷酸苯二钠（C6H5PO4Na2•2H2O） ，溶于 1,000ml 容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，加数滴夜溴以防腐，置冰箱 内可保存一年之久 3． 碱性缓冲液（pH10.0）： 称取无水碳酸钠 6.36g 及碳酸氢钠 3.36g，溶解于 蒸馏水中，并稀释至 1,000ml. 4． 碱性磷酸酶液：称取碱性磷酸酶 1mg,加水 3~4ml，冰箱内可保存五周左右。

实验步骤】 取 6 支试管按下表加入试剂： 123456 2.5mM 磷酸苯0.20.40.60.81.01.0二钠（ml） 蒸馏水（ml）0.80.60.40.2-0.1 碱性缓冲液 （ml）1.01.01.01.01.01.0混匀后，60℃欲温 5 分钟 碱性磷酸酶液 （ml）0.10.10.10.10.1-混匀后，60℃水浴 13 分钟（准确计时） 注意注意：1）加入碱性磷酸酶液要快速、准确用移液枪加 2）此时为酶促反应，总体积 2.1ml 3）第六管不加酶 酚试剂（ml）1.01.01.01.01.01.0 10%Na2CO3(ml )3.03.03.03.03.03.0混匀后，室温放置 15 分钟 注意注意：1）酚试剂为显色剂，同时为酶的变性剂，故加入酚试 剂后酶促反应即停止 2）Na2CO3 提供碱性环境，加入 Na2CO3 后试剂才显色 以 6 管为调零点，在 620nm 波长处比色 【结果处理】 1 将各管光密度和底物浓度记入下表 管号O.D1/O.D[S]1/[S] 1 2 3 4 5 2 以 1/O.D 为纵坐标，1/[s]为横坐标，按 Lineweaver- Burk 作图，求出碱性磷酸 酶的 Km 值。

【注意事项】 1） 加入碱性磷酸酶的量要准确 2） 保温时间要准确准确保温的方法：从第一管加入酶液开始计时，每隔 1 分钟向下一只试管加酶 液,直至加完，到准确 13 分钟立即向第一管加酚试剂，以终止其反应，并每隔 1 分钟向下一只试管加酚试剂,直至加完止，这样保证每管准确保温 13 分钟 【思考题】 1） Km 的意义及其影响因子 2） 为什么酶促反应速度以初速度表示 3） 为什么 O.D 可直接代替 V 作图 4） 分析自己的实验数据实验（二）实验（二）————温度对酶活性的影响温度对酶活性的影响【实验目的】了解温度对酶活性及酶促反应速度的影响，加深对酶特性的认识 【实验原理】每种酶都有其最适温度，高于或低于此温度酶的活性都降低一般而言，若 酶处于过高的温度环境中，会使酶活性永久丧失；而若处于极低温度的环境中 只会使酶活性受到抑制，一旦温度适宜，酶又会全部或部分的恢复其活性 【仪器与试剂】 仪器： 1．冰箱 2.恒温水浴锅 3.试管和试管架 4．吸量管及吸量管架 5.移液枪及枪头 6.胶头滴管 7．烧杯试剂： 1．PH6.8 的缓冲液：量取 15.45ml 的 0.2M 磷酸氢二钠和 4.55ml 的柠檬酸 混合摇匀即可。

2．0.5%淀粉的 0.5%氯化钠溶液：0.5g 可溶性淀粉和 0.5g 氯化钠，溶于 100ml 蒸馏水（需加热） 3．0．03175g/L 碘液 4．1M HCl 溶液 5.1M NaOH 溶液 6.稀释 100 倍的 唾液 7.冰水浴 【实验步骤】 1．制管和预温 由于本实验对恒温反应要求较高，故每个温度梯度使用两支试管，分别标 记为 A 管和 B 管，同时欲温底物与酶A 管加入 PH6.8 的缓冲液和 0.5%淀粉液； B 管使用移液枪加入稀释 100 倍的唾液，相对应的两支试管置于设定的温度下 预温 5min 取 12 支洁净试管，参照下表加入试剂：*6 号管为对照组（比色时作为 0 号管） ，置于室温，且淀粉液用蒸馏水代 替管号1（0℃） 2（室温）3（37℃）4（50℃）5（70℃）6（室温）PH6.8 的 缓冲液 （ml）222222A含 NaCl 的 0.5% 淀粉液 （ml）22222用 2ml 的蒸馏 水代替B稀释 100 倍的唾 液 （ml）1111112．混合 A、B 管 将 1 号 A 管试剂迅速加入温度对应的 B 管中(为了最大限度保证酶的量)， 此时为计时的起点（使用秒表） ，摇匀后放回对应温度继续水浴。

注意：转移 A 管试剂前需将其摇匀 3．时间控制 然后每隔 1min 或 2min（时间自定）按上步操作依次把 2、3、4、5、6 号 的 A、B 管混合 ，严格控制好时间 4．中止反应 准确反应 13min，向 1 号管加入 2 滴 1M HCl 溶液，立即混匀，中止反应， 按上一步的顺序和时间间隔依次对各管进行操作，并移至试管架后再各用 2 滴 1M NaOH 溶液中和每管 5．显色 在每管中各加入 2ml 0.03175g/L 碘液并混匀，观察现象 6．比色 若不同温度梯度间现象差别不明显，则进行比色，通过光密度值来比较 【结果处理】 记录现象（或比较吸光度值） ，做出合理分析 【注意事项】 严格注意时间的控制及各物质的添加量 【思考题】 如果某同学（没有严格按照教案步骤）做出的实验结果为唾液淀粉酶的最适温 度为 70 度，请分析他得出这样的结果的可能原因实验（三）实验（三）————PHPH 对酶活性的影响对酶活性的影响【实验目的】了解 PH 对酶活性及酶促反应速度的影响，加深对酶特性的认识 【实验原理】1.PH 对酶活性影响的机理：PH 影响酶活性中心的某些必须基团的解离,而这 些基团往往仅在某一解离状态时才最容易同底物结合或具有最大催化活性；PH 影响可解离基团的底物和辅酶的荷电状态,从而影响酶对他们的亲和力；PH 还 可以影响酶活性中心的空间构象,从而影响酶的活性。

2.本实验用唾液淀粉酶为材料来观察酶活性受 PH 的影响的情况淀粉在该酶 的催化作用下会随着时间的延长而出现不同程度的水解,从而得到各种糊精乃至 麦芽糖,少量葡萄糖等水解产物碘液与淀粉及其不同程度的水解产物反应呈现 不同颜色,即淀粉(蓝色)、紫色糊精(紫色)、红色糊精(红色)、麦芽糖及少量葡 萄糖(黄色) 【仪器与试剂】 仪器： 1、冰箱 2、电炉 3、恒温水浴锅 4、试管架及试管 5、移液管架及移液管试剂： 1、0.2M 磷酸氢二钠溶液：称取 35.61g 含 2 个结晶水的磷酸氢二钠，用水 定容至 1L 2、0.1M 柠檬酸溶液：称取 21.01g 含一个结晶水的柠檬酸，用水定容至 1L 3、唾液淀粉酶：将唾液分别稀释 10 倍、50 倍和 100 倍，得三种不同浓度 的酶液、 4、0.5%淀粉的 0.5%氯化钠溶液：0.5g 可溶性淀粉和 0.5g 氯化钠，溶于 100ml 蒸馏水（需加热） 5、0.1%淀粉液：0.1g 可溶性淀粉，加到 100ml 蒸馏水中，加热溶解 6、碘液：15g 碘化钾和 12.7g 碘，加少许水使碘完全溶解后，再用水稀释 至 200ml。

7、1%氯化钠溶液 8、0.1%硫酸铜溶液 【实验步骤】（一）PH 对酶活性的影响 1、缓冲溶液的配制 取六只洁净的三角烧瓶，按表 1 编号和加试剂：表 1 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的配制取六支洁净试管，编号后按表 2 操作：表 2 pH 对酶活性的影响管号123456 PH 值5.46.26.87.07.48.0 缓冲液量（ml）333333 含 Nacl 的 0.5%淀粉（ml）222222 稀释 100 倍唾液（ml）222222 充分摇匀，37℃水浴保温，严格控制时间 5min 后，立即向各管加入碘液碘液（滴）333333 充分摇匀，观察各管颜色差异三角烧瓶号123456PH 值5.46.26.87.07.48.00.2M 磷酸二氢钠（ml）11.1513.2215.4516.4718.1719.450.1M 柠檬酸（ml）8.856.784.553.531.830.55【结果处理】 记录现象（或比较吸光度值） ，做出合理分析注意事项】 充分摇匀，严格控制时间 【思考题】 酶的最适 PH 值受哪些因素影响？实验（四）实验（四）————酶浓度对酶活性的影响酶浓度对酶活性的影响【实验目的】 了解酶浓度对酶活性及酶促反应速度的影响，加深对酶特性的认识。