乙肝丙肝核酸检测的新平台(临床).ppt

乙肝丙肝核酸检测的新平台乙肝丙肝核酸检测的新平台 COBASCOBAS AmpliPrep/COBAS TaqManAmpliPrep/COBAS TaqMan 全自动荧光定量分子诊断系统全自动荧光定量分子诊断系统————顾顾 剑剑罗氏分子诊断罗氏分子诊断 自动化程度 1992 1996 1998 2001 2003 2006 MWPCOBASAMPLICOR COBAS AMPLIPREP COBASAMPLICORMONITOR罗氏分子诊断罗氏分子诊断•标准化标准化•自动化自动化•重复性重复性COBAS TAQMAN 48COBAS TAQMAN 96一直以来，罗氏分子诊断对临床一直以来，罗氏分子诊断对临床核酸检测市场提供完善可靠和创核酸检测市场提供完善可靠和创新性的产品及解决方案新性的产品及解决方案目前乙肝和丙肝临床治疗过程中遇到的主要问题目前乙肝和丙肝临床治疗过程中遇到的主要问题•治疗终点无法准确判定•有些病人经一段时间治疗后DNA/RNA检测结果忽阴忽阳，但临床症状依然明显•不能及时预测耐药（病毒学突破）•核苷（酸）类似物治疗后病毒DNA/RNA快速下降至检测限以下，不久却发现病毒出现反跳•疗效的准确监测？？？•治疗后12或24周病毒DNA/RNA下降幅度直接决定预后问题的根源在哪里？问题的根源在哪里？内内 容容•HBV核酸检测的现状与需要核酸检测的现状与需要•HCV核酸检测的现状与需要•罗氏的CAP/CTM能带来什么益处•总结HBV DNA监测在抗病毒治疗中的临床应用监测在抗病毒治疗中的临床应用•HBV DNA是监测抗病毒治疗监测抗病毒治疗响应和时间的关键标志物•HBV 治疗的路线图理念，为HBV DNA监测用于临床实践提供了指导•对用药耐药性的监测用药耐药性的监测（拉米夫定－YMDD，…）•肝移植HBV复发风险的降低（术前，术后）•……HBV DNA监测的的临床床应用用HBV治治疗路路线图 Keeffe E. Clin Gastro Hepatology 2007;5:890-897. 侯金林等，慢性乙型肝炎抗病毒治侯金林等，慢性乙型肝炎抗病毒治疗方案方案优化，中国肝化，中国肝脏病病杂志志国产试剂现状国产试剂现状•目前使用的国产试剂能解决的问题，不能解决的问题：•HBV试剂盒说明：500～5×107 IU/mL•较可信的测试范围：104～5×107 IU/mL•对部分发生HBV病毒突变的病人无法准确检测注：注：1 IU/mL= 1 copy/mL内内 容容•HBV核酸检测的现状与需要•HCV核酸检测的现状与需要核酸检测的现状与需要•罗氏的CAP/CTM能带来什么益处•总结HCV DNA监测在抗病毒治疗中的临床应用监测在抗病毒治疗中的临床应用•HCV病毒感染是可治愈的疾病•HCV RNA检测可以有效指导临床用药•治疗的终点治疗的终点是核酸检测为阴性（核酸检测可以直接指导停药时机）慢性慢性HCV治疗方案治疗方案用药用药12周早期病毒学反应周早期病毒学反应HCV RNA下降下降<2logHCV病毒检测病毒检测阴性阴性HCV病毒检测病毒检测阳性阳性停药停药HCV病毒检测病毒检测阴性阴性治疗到治疗到24周周HCV RNA检测检测HCV RNA下降下降>2log继续治疗至继续治疗至48周周继续治疗至继续治疗至24周周考虑停药考虑停药国产试剂现状国产试剂现状•目前使用的国产试剂能解决的问题，不能解决的问题：•HCV试剂盒说明：500～5×107 IU/mL•较可信的测试范围：104～5×107 IU/mL注：1 IU/mL= 1 copy/mL内内 容容•HBV核酸检测的现状与需要•HCV核酸检测的现状与需要•罗氏的罗氏的CAP/CTM能带来什么益处能带来什么益处•总结全世界第一台用于体外诊断的全自动荧光定量分子诊断系统全世界第一台用于体外诊断的全自动荧光定量分子诊断系统真正实现真正实现 “样品进，结果出样品进，结果出” 全球安装超过全球安装超过 2,000台，国内安装超过台，国内安装超过 40台台COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 系统系统COBAS AmpliPrep / COBAS TaqMan48®系统COBAS AmpliPrep / COBAS TaqMan 96®系统（带连接系统）COBAS AmpliPrep / COBAS TaqMan 96®系统（无连接系统）COBAS AmpliPrep仪器简介仪器简介•全自动系统，自动进行核酸提取纯化和PCR反应体系配制 •基于MGPMGP磁珠磁珠分离技术，确保高质量的核酸提取纯化•最多72个样品可以同时上机，运行中可连续装载上架，提高工作效率•包括耗材、样品、试剂均可以连续上样DNA或者RNA1.裂解、稳定和去蛋白裂解、稳定和去蛋白2.核酸捕获核酸捕获病毒或细胞3.冲洗冲洗4.洗脱洗脱37°C孵育孵育COBAS AmpliPrep仪器仪器MGP 磁珠分离技术磁珠分离技术室温室温80°C孵育孵育•取SPU枪头•样本管/反应管管盖抓手•样本初始体积感应器•取试剂钢针CAP机械臂介绍机械臂介绍样本管/反应管结构COBAS TaqMan/COBAS TaqMan 48分析仪简介分析仪简介•检测通量可达4*24测试•独立的24孔热循环仪•TaqMan 48有2个模块，TaqMan 96有4个模块•最多可同时进行4个不同的分析检测• 操作简单，核酸扩增和检测全部自动完成•实时定量PCR检测技术，卓越的检测性能，灵敏度高和特异性好，动态范围宽HBV-DNA定量测试定量测试用于药品用于药品FDA注册试验注册试验通用名商品名 FDA批准日期关键的HBV-DNA测试Interferon alfa-2bα-2b 干扰素￿INTRON® A1991N/ALamivudine拉米夫定EPIVIR-HBV®1998杂交研究解决方案 1Adefovir dipivoxil阿德福韦酯 HEPSERA™2002Amplicor Monitor 2Entecavir恩替卡韦BARACLUDE™2005Cobas Amplicor 3Peginterferon alfa-2a聚乙二醇干扰素α-2aPEGASYS®2005Cobas Amplicor 4Telbivudine替比夫定TYZEKA™2006Cobas Amplicor 5Tenofovir替诺福韦VIREAD (HIV)Phase 3Cobas TaqMan 6 INTRON® A (Interferon alfa-2b) [package insert]. Schering-Plough Corp. Kenilworth, NJ 2. EPIVIR-HBV® INTRON® A (Interferon alfa-2b) [package insert]. Schering-Plough Corp. Kenilworth, NJ 2. EPIVIR-HBV® (Lamivudine) [package insert] GlaxoSmithKline, Research Triangle park, NC 3. HEPSERA™HEPSERA™ (Adefovir dipivoxil) [package insert] Gilead Sciences. Foster City, CA 4. 4. Pegasys (Peginterferon alfa-2a) [package insert]. Hoffmann-La Roche Inc. Nutley, NJ 5. TYZEKA™ (Telbivudine) [Package Insert]. Novartis Pharmaceuticals Corp. E Hanover, NJ 6. Marcellin P et al. Hep DART TYZEKA™ (Telbivudine) [Package Insert]. Novartis Pharmaceuticals Corp. E Hanover, NJ 6. Marcellin P et al. Hep DART 2007 Meeting 2007 Meeting Abstract 63, Dec 9-13 2007, Lahaina, HI国外发表的文献国外发表的文献•Evaluation of initial virological response to adefovir and development of adefovir-resistant mutations in patients with chronic hepatitis B. Gallego et al., Journal of Viral Hepatitis, 2008, 15, 392–398•Evaluation of an automated, highly sensitive, real-time PCR-based assay (COBAS AmpliprepTM/COBAS TaqManTM) for quantification of HCV RNA. Christoph Sarrazina et al., Journal of Clinical Virology ,2008, 43, 162–168•COBAS AmpliPrep-COBAS TaqMan Hepatitis B Virus(HBV) Test: a Novel Automated Real-Time PCR Assay for Quantification of HBV DNA in Plasma. Tiziano Allice et al., Journal of Clinical Microbiology, Mar. 2007, p. 828–834•Evaluation of the COBAS AmpliPrep-total nucleic acid solation-COBAS TaqMan hepatitis B virus (HBV) quantitative test and comparison to the VERSANT HBV DNA 3.0 assay. Ronsin C et al., Journal of Clinical Microbiology 2006 vol.44(no.4) •Comparison of the COBAS TaqManTM HBV Test With the COBAS Amplicor MonitorTM Test for Measurement of Hepatitis B Virus DNA in Serum. Simon Siu-Man Sum et al., Journal of Medical Virology 2005, 77:486–490•Hepatitis B virus (HBV) genotype determination by the COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 in serum and plasma matrices. Goedel S et al., Journal of Clinical Virology 2009 Jul;45(3):232-6•Comparison of Versant HBV DNA 3.0 and COBAS AmpliPrep-COBAS TaqMan assays for hepatitis B DNA quantitation : Possible clinical implications. GARBUGLIA A. R. et al., Journal of virological methods 2007, vol. 146, no1-2, pp. 274-280 •Performance of the Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan Real-Time PCR Assay for Hepatitis B Virus DNA Quantification. Ste´phane Chevaliez et al., Journal of Clinical, May 2008, p. 1716–1723•……HBV的定量检测性能指标的定量检测性能指标国产国产HBV试剂试剂CAP/CTM HBV灵敏度灵敏度 (LOD)500 IU/mL？12 IU/mL检测范围检测范围104～5×107 IU/mL54 - 1.1×108 IU/mL定量方法定量方法外标法定量内标法定量内标法定量其它其它对部分发生HBV病毒突变的病人无法准确检测涵盖亚型: A-G加强加强pre-core突变检测突变检测注：注：国产试剂国产试剂1 IU/mL= 1 copy/mLHCV的定量检测性能指标的定量检测性能指标国产国产HCV试剂试剂CAP/CTM HCV灵敏度灵敏度 (LOD)500 IU/mL？15 IU/mL检测范围检测范围104～5×107 IU/mL43 – 6.9×107 IU/mL定量方法定量方法外标法定量内标法定量内标法定量其它其它未知1-6 型 (能区分 0.5 log浓度变化)定量原理定量原理外标法定量（国产试剂）外标法定量（国产试剂）•使用一组（4管）外部标准品定量，分别为5×105×104 4到5×107 IU/mL•未考虑各患者血液成分间的差异性各患者血液成分间的差异性对结果的影响定量原理定量原理内标定量内标定量Internal Quantitation Standard(CAP/CTM)•内标是已知拷贝数的人工构建核酸，加入每一反应管，与靶核酸竞争扩增，管内定量•可提示反应是否存在反应抑制，避免假阴性结果避免假阴性结果•充分考虑管间反应效率的差异充分考虑管间反应效率的差异，得到可靠精确的结果 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan系统系统封闭样品管输入，封闭封闭样品管输入，封闭PCR管输出管输出 标准化，重复性标准化，重复性纯化好纯化好的核酸的核酸主反应液主反应液PCRPCR反应体系的配制反应体系的配制试剂、样品和耗材的装载上机试剂、样品和耗材的装载上机样品处理单元K-枪头K-管样品试剂罗氏分子诊断严格的生产和质控体系罗氏分子诊断严格的生产和质控体系为整个行业设定了高标准为整个行业设定了高标准1. 原料严格把关3. GMP生产2. 原料质检4. GMP生产6. 成品质检5. 试剂盒成品7. 资料入档COBAS AmpliPrep /COBAS TaqMan全自动荧光定量分子诊断系统的应用全自动荧光定量分子诊断系统的应用•抗病毒治疗评估和监测（抗病毒治疗评估和监测（HBV/HCV）），为临床医生和病人提高更准确的结果，指导用药。

可针对疑难病例、低病毒载量、长期用药或高端病人•肝移植肝移植的术前术后监控•全国药物、诊断试剂临床评估临床评估实验基地•CAP室间质评时有与国际接轨与国际接轨的平台，评价更科学•基础研究基础研究的工具，文章可信度大大增加国内部分用户国内部分用户省份省份用户用户主要检测项目主要检测项目仪器类型仪器类型北京北京大学人民医院肝炎所（魏来）HBV/HCVCAP/CTM 48北京北京大学基础医学院（庄辉）HBV/HCVCAP/CTM 48北京北京友谊医院（贾继东）HBV/HCVCAP/CTM 48浙江浙江大学附属第一医院（李兰娟）HBV/HCVCAP/CTM 48广东南方医院（侯金林）HBV/HCVCAP/CTM 96北京北京大学第一医院HBV/HCVCAP/CTM 48北京北京协和医院HBV/HCV/HIVCAP/CTM 48上海上海瑞金医院（张欣欣）HBV/HCVCAP/CTM 48四川华西医科大学附属华西医院（唐红）HBV/HCVCAP/CTM 96湖北武汉同济医院HBV/HCVCAP/CTM 48广东广州第八人民医院HBV/HCV/HIVCAP/CTM 48上海上海公共卫生中心HBV/HCV/HIVCAP/CTM 48重庆西南医院(毛青) (装机中)HBV/HCVCAP/CTM 48重庆重医大附二院(任红，张大志) (装机中)HBV/HCVCAP/CTM 48国内用户现已超过40家 国内国内HBV核酸检测实例核酸检测实例•共检测21份国产试剂HBV均为阴性的标本•其中CAP/CTM HBV仍为阴性者共9份，CAP/CTM HBV为阳性者共12份。

阳性率57.1%•1份国产试剂阴性样本，CAP/CTM HBV检测达到106 IU/mL估计因耐药产生HBV病毒突变致使国产试剂无法检测•CAP/CTM HBV在国产试剂阴性样本中的阳性表血清学指标特征血清学指标特征构成比（构成比（CAP/CTM HBV阳性阳性/国产试剂国产试剂HBV阴性）阴性）HBsAg+, HBeAb+, HBcAb+ (小三阳)8/13HBsAg+, HBeAg+, HBcAb+ (大三阳)2/3HBsAg+, HBcAb+1/1HBsAg+, HBeAg+, HBcAb+, HBeAb+1/1HBsAb+, HBcAb+0/2HBsAb+, HBcAb+, HBeAb+0/1总总 结结COBAS AmpliPrep /COBAS TaqMan全自动荧光定量分子诊断系统的特点全自动荧光定量分子诊断系统的特点•国际金标准国际金标准•灵敏度和重复性明显优于国产试剂，对抗病毒治疗重要灵敏度和重复性明显优于国产试剂，对抗病毒治疗重要•唯一内标定量，结果精准唯一内标定量，结果精准•全自动全封闭体系，保证结果的重现性全自动全封闭体系，保证结果的重现性We Innovate Healthcare。