阿魏酸钠抑制高糖诱导系膜细胞表达PAI-1和p38MAPK.doc

1阿魏酸钠抑制高糖诱导系膜细胞表达 PAI-1 和p38MAPK作者：桂华珍 罗华 石明隽 肖瑛 郭兵 张国忠【摘要 】 目的： 观察阿魏酸钠（SF）对高糖诱导系膜细胞（GMC）表达 PAI-1 蛋白和细胞信号转导分子 p38MAPK 的影响方法： 原代培养大鼠肾小球系膜细胞，分为正常组、甘露醇组、高糖组、高糖加不同浓度 SF 组，分别于处理后 24 h、48 h 收集细胞用免疫细胞化学检测各组细胞 p38MAPK 的表达，流式细胞术检测PAI-1 蛋白结果： 48 h 内，高糖促进 PAI-1 和 p38MAPK 蛋白的表达，而 SF 能明显抑制高糖的这种作用，其作用随 SF 浓度的增加和作用时间的延长而加强结论： SF 能拮抗髙糖诱导的 GMC表达 PAI-1 增多和抑制 p38MAPK 信号通路 【关键词】 糖尿病肾病； 葡萄糖； 有丝分裂素激活蛋白激酶类；纤溶酶原激活物抑制物 1； 系膜细胞； 阿魏酸钠［ Abstract］ Objective: To observe the influence of sodium ferulate (SF) on PAI-1 and p38MAPK protein expression of mesangial cells in incubation medium with high glucose. Methods: The primarily cultured glomerular 2mesangial cells (GMCs) were divided into normal glucose group, mannitol group, high glucose group and high glucose plus SF groups of which cells exposed to different concentrations of SF. Cells were collected in 24 h and 48 h after being treated with corresponding agents respectively. The expression of PAI-1 was detected with flow-cytometry and that of p38MAPK protein was detected with immunocytochemistry methods. Results: High glucose significantly promoted the expression of PAI-1 and p38MAPK of GMCs when cultured for 24 h and 48 h. SF inhibited these promotion of PAI-1 and p38MAPK protein induced by high glucose, and the inhibitory effect increased along with the increase of SF concentration and the extension of its affecting time. Conclusion: SF can inhibit the increase of PAI-1 protein and the activation of p38MAPK signal pathway of GMCs induced by high glucose .［ Key words］ diabetic nephropathies; glucose; mitagen-activated protein kinases; plasminogen activator inhibitor 1; mesangial cell; sodium ferulate糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）的发病机制十分复3杂，至今尚未完全阐明，目前认为显著的高血糖引起的肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cell，GMC）分泌细胞外基质（ECM ）成分增多在早期肾小球肥大和晚期肾小球硬化的病理改变中起关键作用[1]。

ECM 在肾小球沉积受纤溶酶等蛋白分解酶类和其抑制物的共同作用，纤溶酶原激活物抑制剂（PAI）可以抑制ECM 降解而促进其沉积[2]丝裂原活化蛋白激酶（ MAPK）是重要的细胞内信号转导物，已有研究表明可能介导 DN 的发病，其中 p38MAPK 在 DN 发病机制中起重要作用[3，4] 阿魏酸钠(sodium ferulate, SF)是一种内皮素拮抗剂，具有广泛的药理作用，已有作者用其治疗糖尿病肾病取得良好效果，然而其作用机理尚未完全阐明[5]2006 年 4 月~2007 年 12 月用原代培养 GMC，观察高糖培养环境中 GMC 表达 PAI-1 和 p38MAPK 蛋白的变化以及阿魏酸钠对其影响，为进一步了解 SF 治疗 DN 的作用机制提供实验依据1 材料和方法1.1 材料1.1.1 主要试剂 阿魏酸钠（吉林西点药业科技发展股份有限公司）；甘露醇（石家庄制药有限公司） ；MEM 培养基（美国 Gibco 公司）；L- 谷氨酰胺、4- 甲基偶氮唑蓝(MTT) 、二甲基亚砜(DMSO) 、胰蛋4白酶（美国 Sigma 公司） ；胎牛血清(FCS ，Hyclone 公司)；抗PAI-1 抗体、抗 p38MAPK 抗体、SABC 试剂盒（武汉博士德） 。

1.1.2 主要仪器设备 CO2 孵箱（美国 REVCO） ；倒置显微镜(OLYMPUS)；流式细胞仪（美国 BD 公司） ； CM-2000B 型生物医学图像分析系统(北京) 1.2 方法1.2.1 大鼠原代肾小球系膜细胞培养 大鼠双肾灌洗后，分级筛网滤过分离肾小球，用Ⅳ型胶原酶消化处理，种植法体外培养培养细胞按已建立的方法鉴定，确定为系膜细胞，取第 3~4 代细胞供实验用[6]1.2.2 实验分组 正常组（5.5 mmol/L D-葡萄糖） ；SF 加正常糖培养组（SF240 mg/L 加 5.5 mmol/L D-葡萄糖） ；甘露醇组（5.5 mmol/L D-葡萄糖加 24.5 mmol/L 甘露醇组)；高糖组（30 mmol/L D-葡萄糖） ；SF 加高糖培养组（SF60、120、240 mg/L加 30 mmol/L D-葡萄糖） 各组分别于培养 24 h 和 48 h 时收集细胞用于检测1.2.3 用台盼蓝染色，检测存活细胞比例51.2.4 免疫细胞化学法检测 p38MAPK 蛋白表达 预先在 12 孔板中加入无菌玻片，向每孔中加入 1 ml 细胞数为 1×105/m1 的GMC，细胞周期同步后，药物作用 24 h 和 48 h，收集爬片细胞，95%乙醇固定，山羊血清封闭，滴加 1 抗体 (1∶50)于细胞爬片，4 ℃孵育过夜，再加生物素化二抗，DAB 显色，生物医学图像分析系统分析图像, 得出阳性积分光密度 A 值。

1.2.5 流式细胞仪测定 PAI-1 的表达水平 调整 GMC 数为5×105 个/ml ，接种于 50 ml 培养瓶中，分组培养，分别于 24 h和 48 h 收集细胞制成单细胞悬液，PBS 洗涤 2 次，用 PBS 调节细胞数为 1×106 个/ml，分装于 EP 管中(1 ml/管)，无水乙醇固定加入 0.5 ml 0.1% Triton X-100，每组 12 管细胞随机分为 6 管阴性对照，6 管实验组，实验组加入 50 μl PAI-1 抗体，对照组加入50 μl 生理盐水代替一抗，37 ℃震荡水浴 20 min，洗掉未结合的抗体，加入 50 μl FITC 标记的二抗（1∶40） ，流式细胞仪测 1×104个以上细胞的 PAI-1，MCYCLE 软件分析细胞的荧光强度，以平均荧光强度（MFI）表示蛋白的表达量1.2.6 统计方法 全部数据采用 SPSS10.0 统计软件包进行分析计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用 q 检验，检验水准以 P<0.05 为差异有显著性62 结果2.1 阿魏酸钠对 GMC 存活的影响SF 3 个剂量组的 GMC 经台盼蓝染色，活细胞数在 96%以上，表明所用剂量范围的 SF 对 GMC 无明显毒性。

2.2 高糖对 GMC 表达 p38MAPK 和 PAI-1 蛋白的影响免疫细胞化学显示，正常组和甘露醇组 GMC 胞浆可见p38MAPK 蛋白表达，胞核偶见表达；高糖培养 24 h 和 48 h， GMC 胞浆 p38MAPK 表达显著增多，并且可见较多 p38MAPK在细胞核阳性表达流式细胞术结果表明，正常组和甘露醇组 GMC有 PAI-1 蛋白表达；高糖培养 24 h 和 48 h，GMC 表达 PAI-1 蛋白的荧光强度显著增高各组 p38MAPK 和 PAI-1 蛋白的表达程度见表 1在髙糖培养 24 h 和 48 h 2 个时间点，GMC 表达的p38MAPK 与 PAI-1 蛋白之间呈显著正相关，相关系数分别为0.925 和 0.907，均 P﹤0.012.3 不同浓度阿魏酸钠对髙糖诱导 GMC 表达 p38MAPK 和PAI-1 蛋白的影响7免疫细胞化学显示，SF60 mg/L 髙糖组培养 24 h，与同时点髙糖组相比，GMC 胞浆 p38MAPK 蛋白的表达比同时点的高糖组显著减少，同时 p38MAPK 在细胞核内的阳性表达亦减少（图 1） 流式细胞术结果表明，SF60 mg/L 髙糖组培养 24 h，与同时点髙糖组相比，GMC 表达 PAI-1 的荧光强度已明显减少。

随 SF 浓度增加，p38MAPK 和 PAI-1 蛋白的表达减少更显著，浓度为 240 mg/L 的 SF 与 60 mg/L 相比，差异有显著性；而浓度为 120 mg/L 与 60 mg/L 相比，只有 24 h 时点 p38MAPK 的表达差异有显著性相同浓度 SF 作用 48 h，p38MAPK 和 PAI-1 蛋白的表达似比作用 24 h 减少，但无统计学意义见表 1表 1 高糖和阿魏酸钠对肾小球系膜细胞表达 p38MAPK 和 PAI-1 蛋白的影响 (1)与相同时间正常组比较，P<0.01 ； (2)与相同处理时间高糖组比较，P<0.01；(3)与相同处理时间阿魏酸钠(SF)60 mg/L 组比较，P<0.053 讨论糖尿病肾病是糖尿病常见的并发症，最终导致肾小球硬化和肾小管间质纤维化而发展为终末期肾病髙血糖刺激系膜细胞生物学行为改变，使 ECM 在肾小球过度沉积，使肾小球肥大乃至硬化[2]过去的研究表明，链尿菌素性糖尿病大鼠，肾小球系膜细胞发生表型转变而表达 α- 平滑肌肌动蛋白（α-SMA） ，使纤维连接蛋白等8ECM 在系膜区沉积[7]；ECM 过度沉积可能为其生成增多和分解减少所致。

有研究表明，高浓度葡萄糖环境培养的 GMC 组织纤溶酶原激活物（tPA）生成减少，而其抑制物 PAI-1 增多，从而抑制了ECM 降解，尤其是 PAI-1 起重要作用，通过抑制纤溶酶生成而明显减少 ECM 的分解[8] 研究表明，正常浓度葡萄糖和高浓度甘露醇培养的大鼠原代 GMC 只表达少量 PAI-1，而高浓度葡萄糖可使GMC 表达 PAI-1 显著增多，提示了髙糖能促进 GMC 表达 PAI-1蛋白，与其他作者的结果一致[8]p38MAPK 是 MAPK 家族成员，作为信号分子参与细胞的多种生理、病理过程研究表明，高浓度葡萄糖可显著增多 GMC胞浆和胞核 p38MAPK 蛋白表达，提示髙糖可使 GMC 生成p38MAPK 蛋白并促进其磷酸化而转移入细胞核，调节 DNA 的转录，与其。