第九章聚合酶链反应及相关技术ppt课件.ppt

第九章第九章 聚合酶链反响及相关技术聚合酶链反响及相关技术上海交通大学上海交通大学 樊绮诗樊绮诗•聚合酶链反响于二十世纪聚合酶链反响于二十世纪8080年代由年代由K.MullisK.Mullis建立，建立，并和定点突变的发明者并和定点突变的发明者M.SmithM.Smith一同荣获一同荣获19931993年度年度• 诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研讨开创了崭诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研讨开创了崭新时代第一节第一节 聚合酶链反响聚合酶链反响第二节第二节 以以PCRPCR为根底的相关技术为根底的相关技术第三节第三节 PCR PCR产物的检测产物的检测第一节第一节 聚合酶链反响聚合酶链反响•聚合酶链反响〔聚合酶链反响〔polymerase chain reaction, PCRpolymerase chain reaction, PCR〕是〕是DNADNA体外复制反响，根本原理与细胞内体外复制反响，根本原理与细胞内DNADNA的复的复制类似制类似 第一节第一节 聚合酶链反响聚合酶链反响第一节第一节 聚合酶链反响聚合酶链反响一、一、PCRPCR反响原理、反响过程和特点反响原理、反响过程和特点二、二、PCRPCR的反响体系的反响体系三、三、PCRPCR的反响条件的反响条件四、四、PCRPCR技术的质量控制技术的质量控制一、一、PCRPCR反响原理和反响过程反响原理和反响过程1.1.原理原理 DNA DNA的体外复制包括的体外复制包括3 3个步骤：个步骤：变性〔变性〔denaturationdenaturation〕〕: 94: 94 C C～～9595 C C退火〔退火〔annealingannealing〕〕 : 40 : 40 C C～～7070 C C 延伸〔延伸〔extensionextension〕〕 : 72 : 72 C C •变性变性: DNA: DNA双螺旋的氢键断裂，构成单链分子作为双螺旋的氢键断裂，构成单链分子作为 反响的模板反响的模板 •退火退火: : 引物与模板互补结合，构成杂交链引物与模板互补结合，构成杂交链 •延伸延伸: : 按照模板链的序列以互补的方式依次把按照模板链的序列以互补的方式依次把dNTPdNTP加至引物的加至引物的3´3´端，端，Taq DNATaq DNA聚合酶使杂交双链不断聚合酶使杂交双链不断延伸，直至构成新的延伸，直至构成新的DNADNA双链双链 一、一、PCRPCR反响原理和反响过程反响原理和反响过程5’5’3’3’d.NTPs耐热DNA聚合酶引物5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’退火退火参与试管中参与试管中添加反响混添加反响混合液及样本合液及样本变性变性一、一、PCRPCR反响原理和反响过程反响原理和反响过程5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’TaqTaq3’5’3’TaqTaq5’5’循环循环延伸延伸继续延伸继续延伸一、一、PCRPCR反响原理和反响过程反响原理和反响过程5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’3’第二个循环第二个循环4 4个拷贝个拷贝第三个循环第三个循环8 8个拷贝个拷贝5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’第第n n个循环个循环2n2n个拷贝个拷贝一、一、PCRPCR反响原理和反响过程反响原理和反响过程2.2.特点特点•特异性强特异性强• 引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性 •灵敏度高灵敏度高• 指数增长，从指数增长，从pg (10-12)pg (10-12)可扩增至可扩增至 mg (10-6) mg (10-6)程度程度 •简便、快速简便、快速• 2 2～～4 4 小时完成扩增反响小时完成扩增反响一、一、PCRPCR反响原理和反响过程反响原理和反响过程二、二、PCRPCR的反响体系的反响体系参与参与PCRPCR反响的主要成份反响的主要成份: :1.1.模板模板2.2.引物引物3.3.脱氧核苷三磷酸脱氧核苷三磷酸4.Taq DNA4.Taq DNA聚合酶聚合酶5.5.镁离子浓度镁离子浓度6.6.其它反响要素其它反响要素1.1.模板〔模板〔templatetemplate〕〕•基因组基因组DNADNA、、RNARNA、质粒、质粒DNADNA、线粒体、线粒体DNADNA等等•RNARNA作为模板时，须先将作为模板时，须先将RNARNA逆转录为逆转录为cDNA cDNA •模板量：模板量：1000ng1000ng、、500ng500ng、、100ng100ng、、50ng50ng•反响体系中较低量的模板有利于提高扩增反响体系中较低量的模板有利于提高扩增产量和减少非特异性扩增产量和减少非特异性扩增 二、二、PCRPCR的反响体系的反响体系2.2.引物引物(primer)(primer)•化学合成的寡核苷酸化学合成的寡核苷酸•与模板特异地结合与模板特异地结合•决议产物的特异性和长度决议产物的特异性和长度二、二、PCRPCR的反响体系的反响体系设计引物的原那么设计引物的原那么( (一一) )•两条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板两条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负链序列互补正负链序列互补•长度为长度为1818～～2525个核苷酸个核苷酸•二条引物之间防止构成引物二聚体二条引物之间防止构成引物二聚体•引物浓度：引物浓度：0.10.1～～0.2μmol/L0.2μmol/L，浓度过高容易生，浓度过高容易生成引物二聚体成引物二聚体二、二、PCRPCR的反响体系的反响体系设计引物的原那么设计引物的原那么( (二二) )•引物的碱基组成应平衡，引物的碱基组成应平衡，C+G C+G 碱基含量在引物中碱基含量在引物中的比例普通以的比例普通以45%45%～～55%55%为宜为宜 •引物退火温度计算：引物退火温度计算：Tm=2Tm=2〔〔A+TA+T〕〕+4+4〔〔C+GC+G〕〕•引物的引物的5´5´端可被修饰〔引入酶切位点、引入突变端可被修饰〔引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标志〕位点、生物素等标志〕二、二、PCRPCR的反响体系的反响体系3.3.脱氧核苷三磷酸〔脱氧核苷三磷酸〔dNTPdNTP〕〕 •dATPdATP、、dCTPdCTP、、dGTPdGTP和和dTTPdTTP的混合物的混合物 •反响体系中各种核苷酸的浓度必需一致反响体系中各种核苷酸的浓度必需一致 •浓度过高虽能加快反响速度，但非特异浓度过高虽能加快反响速度，但非特异性扩增也随之添加性扩增也随之添加 •最适浓度：最适浓度：2020～～200μmol/L200μmol/L二、二、PCRPCR的反响体系的反响体系4.Taq DNA4.Taq DNA聚合酶聚合酶 从一种生活在热泉〔从一种生活在热泉〔80℃～～90℃〕中〕中的水栖噬热菌〔的水栖噬热菌〔Thermus aquaticus, Taq〕〕中提取，有很高的耐热稳定性中提取，有很高的耐热稳定性 二、二、PCRPCR的反响体系的反响体系Taq Taq 酶的作用酶的作用: :在模板指点下，以在模板指点下，以dNTPdNTP为原料，在引物为原料，在引物3´-OH3´-OH末端末端加上脱氧单核苷酸，构成加上脱氧单核苷酸，构成3´, 5´-3´, 5´-磷酸二酯键，磷酸二酯键，使使DNADNA链沿链沿5´→ 3´5´→ 3´方向延伸，催化方向延伸，催化DNADNA合成合成 最适酶量：最适酶量：1 1～～2.5U2.5U二、二、PCRPCR的反响体系的反响体系•Taq DNATaq DNA聚合酶无聚合酶无3´→ 5´3´→ 5´外切酶活性，因此无校外切酶活性，因此无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配 •Taq DNATaq DNA聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为1/300001/30000，碱基交换率为，碱基交换率为1/80001/8000，因此扩增的片段，因此扩增的片段越长，错配的机率越高越长，错配的机率越高 二、二、PCRPCR的反响体系的反响体系•耐热的高保真耐热的高保真 DNA DNA多聚合酶：多聚合酶：• Pwo DNA polymerase Pwo DNA polymerase• Tth DNA polymerase Tth DNA polymerase• Pfu DNA polymerase Pfu DNA polymerase•高热稳定性，高保真性，能降低碱基错配率高热稳定性，高保真性，能降低碱基错配率二、二、PCRPCR的反响体系的反响体系5.5.镁离子浓度镁离子浓度•对反响系统本身、稳定核苷酸和提高对反响系统本身、稳定核苷酸和提高Taq Taq 酶的活性酶的活性有直接影响有直接影响•PCRPCR反响体系中反响体系中dNTPdNTP、引物、模板、引物、模板DNADNA及鳌合剂均可及鳌合剂均可与与Mg2+Mg2+结合，降低游离结合，降低游离Mg2+Mg2+的浓度，影响酶的活性的浓度，影响酶的活性•dNTPdNTP浓度为浓度为200μmol/L200μmol/L时，时，MgCl2MgCl2浓度为浓度为1.5mmol/L1.5mmol/L较宜较宜二、二、PCRPCR的反响体系的反响体系6.6.其它反响要素其它反响要素•pHpH：反响所需的最适：反响所需的最适pHpH值在值在7.27.2左右左右 •盐：适宜的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引盐：适宜的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物与模板杂交物与模板杂交 •基质：牛血洁白蛋白、明胶、基质：牛血洁白蛋白、明胶、Tween20Tween20、、DTTDTT等等 二、二、PCRPCR的反响体系的反响体系三、三、PCRPCR的反响条件的反响条件 1.1.反响温度〔变性、退火、延伸〕反响温度〔变性、退火、延伸〕2.2.反响时间〔变性、退火、延伸〕反响时间〔变性、退火、延伸〕3.3.循环次数〔循环次数〔PCRPCR效率及产物量〕效率及产物量〕4.PCR4.PCR过程的实时监测过程的实时监测1.1.反响温度反响温度 •变性温度：变性温度：94℃94℃～～97℃97℃•退火温度：低于引物退火温度：低于引物Tm 5℃Tm 5℃左右左右• 温度过高：降低扩增效率温度过高：降低扩增效率• 温度过低：添加非特异性扩增温度过低：添加非特异性扩增•延伸温度：延伸温度：72℃72℃三、三、PCRPCR的反响条件的反响条件 2.2.反响时间反响时间 •第一次变性应给予足够时间第一次变性应给予足够时间•每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，时间过长易导致非特异性扩增时间过长易导致非特异性扩增三、三、PCRPCR的反响条件的反响条件 3.3.循环次数循环次数 •普通设为普通设为2525～～3535个循环个循环•每一个循环使一个分子的模板被复制为二个，每一个循环使一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数方式增长产物量以指数方式增长三、三、PCRPCR的反响条件的反响条件 •一个分子的模板经过一个分子的模板经过3030个循环，实际上即个循环，实际上即可得可得230(230(约约109)109)个拷贝产物个拷贝产物 •实践反响中，每个循环的扩增效率大多约实践反响中，每个循环的扩增效率大多约为为85%85%左右左右三、三、PCRPCR的反响条件的反响条件 扩增反响的平台效应：扩增反响的平台效应： PCR PCR反响产物呈指数性增长，但这种增长方反响产物呈指数性增长，但这种增长方式在扩增式在扩增2525～～3535个循环以后便放慢直至停顿，个循环以后便放慢直至停顿，到达反响平台，此时扩增产物量不再随循环次到达反响平台，此时扩增产物量不再随循环次数的添加而呈指数增长。

数的添加而呈指数增长三、三、PCRPCR的反响条件的反响条件 n指数增长期指数增长期n线形增长期线形增长期n平台期平台期循环数 实际值 实践值Log 产物DNA4.PCR实时监测实时监测三、三、PCRPCR的反响条件的反响条件 •平台出现得迟早与模板的初始量有关，模板初始平台出现得迟早与模板的初始量有关，模板初始量越多，平台出现得越早量越多，平台出现得越早•平台效应产生的要素：平台效应产生的要素：• 引物二聚体的产生引物二聚体的产生• 反响体系各组分的耗费反响体系各组分的耗费• 引物和已扩增的引物和已扩增的DNADNA片段间的竞争等片段间的竞争等三、三、PCRPCR的反响条件的反响条件 四、四、PCRPCR技术的质量控制技术的质量控制1.1.实验室的规范化设置实验室的规范化设置试剂储存和预备区试剂储存和预备区 标本制备区标本制备区 扩增反响区扩增反响区 产物分析区产物分析区 2.2.防污染体系：防污染体系：正确设置实验室、严厉规范实验操作、完好有效正确设置实验室、严厉规范实验操作、完好有效的去污染措施的去污染措施 反响体系中以反响体系中以dUTPdUTP取代取代dTTPdTTP，参与尿嘧啶糖苷酶，参与尿嘧啶糖苷酶〔〔UNGUNG〕，破坏以往的扩增产物〕，破坏以往的扩增产物 每次实验终了后须用每次实验终了后须用1g/L1g/L次氯酸钠清洁实验台面，次氯酸钠清洁实验台面，或用或用254nm254nm波长的紫外光近间隔充分照射波长的紫外光近间隔充分照射 四、四、PCRPCR技术的质量控制技术的质量控制3.PCR3.PCR技术的质量保证技术的质量保证基因扩增检验的全过程的质量保证基因扩增检验的全过程的质量保证 分析前分析前 分析中分析中 分析后分析后室内质量控制和室间质量评价室内质量控制和室间质量评价四、四、PCRPCR技术的质量控制技术的质量控制第二节第二节 以以PCRPCR为根底的相关技术为根底的相关技术第二节第二节 以以PCRPCR为根底的相关技术为根底的相关技术一、逆转录一、逆转录PCRPCR二、定量二、定量PCRPCR三、多重三、多重PCRPCR四、四、PCRPCR诱导定点突变诱导定点突变五、衔接酶链式反响五、衔接酶链式反响六、随机扩增多态性六、随机扩增多态性DNADNA一、逆转录一、逆转录PCRPCR〔〔RT-PCRRT-PCR〕〕•以细胞内总以细胞内总RNARNA或或mRNAmRNA为资料进展体外扩增为资料进展体外扩增的技术的技术•主要用于克隆主要用于克隆 cDNA cDNA、合成、合成cDNAcDNA探针，检测探针，检测RNARNA病毒、分析基因表达等病毒、分析基因表达等逆转录合成逆转录合成cDNAcDNA所用的引物：所用的引物：•以以PCRPCR扩增所需的下游引物作为逆转录反响的引物扩增所需的下游引物作为逆转录反响的引物•以以oligo(dT)oligo(dT)作为引物作为引物•以人工合成的随机序列〔六核苷酸混合物〕作为引以人工合成的随机序列〔六核苷酸混合物〕作为引物物一、逆转录一、逆转录PCRPCR〔〔RT-PCRRT-PCR〕〕一、逆转录一、逆转录PCRPCR二、定量二、定量PCR(quantitative PCR)PCR(quantitative PCR)•对对DNADNA或或RNARNA样本的靶序列进展定量分析样本的靶序列进展定量分析•主要用于基因表达的分析、病原体核酸的检测等主要用于基因表达的分析、病原体核酸的检测等•荧光定量荧光定量PCRPCR〔〔fluorescence quantitative fluorescence quantitative PCR,FQ-PCRPCR,FQ-PCR〕，又称实时〕，又称实时PCR(real-time PCR)PCR(real-time PCR)•FQ-PCRFQ-PCR经过荧光信号对经过荧光信号对PCRPCR过程中的产物量进展实过程中的产物量进展实时监测，准确计算出时监测，准确计算出PCRPCR的初始模板量的初始模板量 二、定量二、定量PCRPCR荧光信号的检测方法荧光信号的检测方法二、定量二、定量PCRPCR1.DNA1.DNA结合染料技术结合染料技术2.2.水解探针技术水解探针技术3.3.杂交探针技术杂交探针技术4.4.分子信标技术分子信标技术1.DNA1.DNA结合染料技术结合染料技术•PCRPCR反响体系中参与反响体系中参与SYBR Green ISYBR Green I染料，能选染料，能选择性地掺入至双链择性地掺入至双链DNADNA分子中，并且产生剧烈分子中，并且产生剧烈荧光荧光 •PCRPCR过程中，过程中，SYBR Green ISYBR Green I染料结合到新合成染料结合到新合成的双链的双链DNADNA分子中，结合的荧光信号和分子中，结合的荧光信号和DNADNA含量含量成正比成正比 二、定量二、定量PCRPCR                                                                                                                                                  二、定量二、定量PCRPCR•优点：本钱较低，无须对引物或探针进展特殊的优点：本钱较低，无须对引物或探针进展特殊的荧光标志，操作亦比较简单荧光标志，操作亦比较简单 •缺陷：特异性不够，染料分子会结合到非特异性缺陷：特异性不够，染料分子会结合到非特异性扩增产生的双链分子和引物二聚体中，使反响体扩增产生的双链分子和引物二聚体中，使反响体系中的荧光本底较高系中的荧光本底较高 二、定量二、定量PCRPCR2.2.水解探针技术技术水解探针技术技术 荧光素标志探针荧光素标志探针 探针的探针的5´5´端和端和3´3´端分别标志荧光报告基团端分别标志荧光报告基团R R和和荧光淬灭基团荧光淬灭基团Q Q 探针完好时探针完好时R R基团与基团与Q Q基团分别位于探针的二端，基团分别位于探针的二端，Q Q基团抑制基团抑制R R基团使其不能发射荧光基团使其不能发射荧光 二、定量二、定量PCRPCR荧光信号检测荧光信号检测 PCR PCR过程中，过程中，Taq DNATaq DNA聚合酶沿模板挪动，其聚合酶沿模板挪动，其 5´→3´ 5´→3´外切核酸酶活性，可逐个水解脱氧核外切核酸酶活性，可逐个水解脱氧核 苷三磷酸，苷三磷酸，R R基团与基团与Q Q基团随之分别基团随之分别 R R基团不再受基团不再受Q Q基团的抑制便发射荧光，基团的抑制便发射荧光，R R基团信基团信 号强弱的程度与号强弱的程度与PCRPCR反响产物的拷贝数成正比反响产物的拷贝数成正比 二、定量二、定量PCRPCR水水 解解 探探 针针 技技 术术二、定量二、定量PCRPCR二、定量二、定量PCRPCR3.3.杂交探针技术〔杂交探针技术〔hybridization probehybridization probe〕〕•反响体系需求反响体系需求2 2条探针条探针• 探探针针A A的的3´3´端端标标以以荧荧光光素素作作为为荧荧光光染染料料供供体体；；探探针针B B的的5´5´端端标标以以另另一一种种染染料料，，作作为为荧荧光光染染料料受受体。

体•2 2个个探探针针的的序序列列头头尾尾陈陈列列，，并并且且相相距距仅仅间间隔隔1 1个个碱基，从而可以进展荧光共振能量的转移碱基，从而可以进展荧光共振能量的转移 二、定量二、定量PCRPCR•外外来来光光源源首首先先刺刺激激供供体体荧荧光光染染料料，，供供体体便便发发光光刺刺激激附附近近的的受受体体荧荧光光染染料料，，使使后后者者再再发发射射出出具具另一种波长的信号而被检测系统接纳另一种波长的信号而被检测系统接纳 •受受体体荧荧光光染染料料在在2 2个个探探针针都都与与模模板板杂杂交交时时才才会会被激发而发射荧光信号被激发而发射荧光信号 二、定量二、定量PCRPCR•分子信标是一段荧光素标志的寡核苷酸分子信标是一段荧光素标志的寡核苷酸•环状区环状区(15(15～～3030个核苷酸个核苷酸) ) •柄区柄区(5(5～～8 8个碱基对个碱基对) )组成组成•5´5´末端标志荧光基团末端标志荧光基团•3´3´末端标志淬灭基团末端标志淬灭基团4.4.分子信标技术〔分子信标技术〔molecular beaconmolecular beacon〕〕二、定量二、定量PCRPCR•在自在形状下，分子信标的构造呈发夹状，两端在自在形状下，分子信标的构造呈发夹状，两端的基团相距较近，荧光基团将能量转移给淬灭基的基团相距较近，荧光基团将能量转移给淬灭基团而使荧光淬灭，荧光本底极低团而使荧光淬灭，荧光本底极低 •当分子信标与序列互补的靶分子结合时，分子信当分子信标与序列互补的靶分子结合时，分子信标的构型发生变化，柄部被翻开，从而使荧光基标的构型发生变化，柄部被翻开，从而使荧光基团远离淬灭基团而发射荧光团远离淬灭基团而发射荧光 二、定量二、定量PCRPCR分子信标技术原理分子信标技术原理R二、定量二、定量PCRPCR定量定量 PCR PCR参照系统参照系统二、定量二、定量PCRPCR1.1.外参照系统的设置外参照系统的设置2.2.内参照系统的设置内参照系统的设置1.1.外参照系统外参照系统CtCt值值(cycle threshold)(cycle threshold)扩扩增增曲曲线线与与荧荧光光本本底底基基线线的的交交叉叉点点处处相相应应的的反反响响循循环环数数, ,即即每每个个反反响响管管内内的的荧荧光光信信号号到到达达设设定定的的域域值时所阅历的循环数值时所阅历的循环数 CtCt值值与与模模板板的的起起始始拷拷贝贝数数的的对对数数存存在线性性反反比比关关系系，，起始拷贝数越多，起始拷贝数越多，CtCt值越小值越小 二、定量二、定量PCRPCR一样模板进展一样模板进展9696次扩增的扩增曲线图次扩增的扩增曲线图二、定量二、定量PCRPCR•利利用用知知起起始始拷拷贝贝数数的的规规范范品品作作出出规规范范曲曲线线，，横横坐坐标标代代表表起起始始拷拷贝贝数数的的对对数数，，纵坐标代纵坐标代CtCt值值 •获获得得未未知知样样品品的的CtCt值值，，即即可可从从规规范范曲曲线线上上计计算算出出该该样品的起始拷贝数样品的起始拷贝数 二、定量二、定量PCRPCR2.2.内参照系统内参照系统•内规范品内规范品: :一段人为地引入了突变序列的靶基一段人为地引入了突变序列的靶基因片段因片段 •内规范品参与被检样品中一同抽提、扩增内规范品参与被检样品中一同抽提、扩增 •内规范品和靶基因的探针分别用内规范品和靶基因的探针分别用2 2种不同的荧种不同的荧光染料标志，二者探针杂交的序列不同光染料标志，二者探针杂交的序列不同 二、定量二、定量PCRPCR•同一对引物同时扩增靶基因和内规范品，双通道同一对引物同时扩增靶基因和内规范品，双通道荧光检测系统可以特异地同时检测出内规范品和荧光检测系统可以特异地同时检测出内规范品和靶基因的扩增产物，计算出靶基因起始拷贝数靶基因的扩增产物，计算出靶基因起始拷贝数 •内参照系统防止了由于不同抽提效率导致的样本内参照系统防止了由于不同抽提效率导致的样本间的差别，使结果的反复性更好，定量更为准确间的差别，使结果的反复性更好，定量更为准确,但仍不能监控内规范品和靶基因能否有一致的扩但仍不能监控内规范品和靶基因能否有一致的扩增效率增效率 二、定量二、定量PCRPCR三、多重三、多重PCR(multiplex PCR)PCR(multiplex PCR)• 在同一反响体系中参与多对引物，同时扩在同一反响体系中参与多对引物，同时扩增一份增一份 • DNA DNA样本中多个靶片段样本中多个靶片段四、四、PCRPCR诱导定点突变诱导定点突变1.1.引入点突变引入点突变ABABP2P1PCR用酶用酶A A和和B B消化，将突变位点引入消化，将突变位点引入PCRPCR产物产物2.2.引入大片段缺失引入大片段缺失四、四、PCRPCR诱导定点突变诱导定点突变五、衔接酶链反响五、衔接酶链反响(LCR(LCR〕〕空隙空隙LCR LCR 引物与模板特异性互补引物与模板特异性互补引物引物A A和和B B之间、之间、a a和和b b之之间有一段空隙间有一段空隙空隙在空隙在DNADNA聚合酶的作用聚合酶的作用下特异性延伸下特异性延伸衔接酶衔接缺口衔接酶衔接缺口 六、随机扩增多态性六、随机扩增多态性DNA(RAPD) DNA(RAPD) RAPDRAPD是一种在整个基因组是一种在整个基因组DNADNA内进展随机扩增而获得内进展随机扩增而获得多态性长度多态性长度DNADNA片段的技术片段的技术 用一条随机序列的引物与模板用一条随机序列的引物与模板DNADNA序列作随机配对，序列作随机配对，反响过程中随机引物只需在与模板反响过程中随机引物只需在与模板DNADNA互补后，在互补后，在足够近的间距足够近的间距(200(200～～2000bp)2000bp)内、方向相对的两个内、方向相对的两个引物片段之间的模板引物片段之间的模板DNADNA序列才干被扩增序列才干被扩增 六、随机扩增多态性六、随机扩增多态性DNADNA•不同个体不同个体DNADNA序列之间存在差别或发生突变，经扩序列之间存在差别或发生突变，经扩增所得到的产物片段长度会有所不同，经过电泳增所得到的产物片段长度会有所不同，经过电泳分别便可以发现这种差别，从而可了解和比较两分别便可以发现这种差别，从而可了解和比较两个生物体之间基因组个生物体之间基因组DNADNA的构造等信息的构造等信息  随机扩增多态性随机扩增多态性DNADNA六、随机扩增多态性六、随机扩增多态性DNADNARAPDRAPD的运用的运用种群生物学研讨种群生物学研讨基因组基因组DNADNA图谱构建图谱构建遗传鉴定遗传鉴定临床致病菌的流行病学检测和分型临床致病菌的流行病学检测和分型DNADNA指纹鉴定指纹鉴定 六、随机扩增多态性六、随机扩增多态性DNADNA第三节第三节 PCR PCR产物的检测产物的检测第三节第三节 PCR PCR产物的检测产物的检测一、一、PCR-PCR-限制性片段长度多态性〔限制性片段长度多态性〔PCR-RFLPPCR-RFLP〕〕二、等位基因特异性寡核苷酸〔二、等位基因特异性寡核苷酸〔ASOASO〕〕三、单链构象多态性〔三、单链构象多态性〔SSCPSSCP〕〕四、变性梯度凝胶电泳〔四、变性梯度凝胶电泳〔DGGEDGGE〕〕五、融点曲线分析五、融点曲线分析(melting curve analysis)(melting curve analysis)六、六、PCRPCR产物的序列分析〔产物的序列分析〔sequencingsequencing〕〕一、一、 PCR- PCR-限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性•PCR-RFLPPCR-RFLP是对是对PCRPCR产物作限制性片段长度多态性产物作限制性片段长度多态性分析分析•根据根据PCRPCR产物的突变序列能否位于限制性内切酶产物的突变序列能否位于限制性内切酶的酶切位点内而设计的酶切位点内而设计•突变点在某一限制性内切酶的酶切位点序列时，突变点在某一限制性内切酶的酶切位点序列时，可在突变点的二侧设计引物，或经过改动引物可在突变点的二侧设计引物，或经过改动引物序列使扩增产物产生〔或消逝〕酶切位点序列使扩增产物产生〔或消逝〕酶切位点•用相应的内切酶对扩增产物进展水解并作电泳用相应的内切酶对扩增产物进展水解并作电泳分别，分别，PCRPCR产物能〔或不能〕被酶水解而产生产物能〔或不能〕被酶水解而产生不同长度的片段不同长度的片段•根据水解片段的大小和相应电泳位置可区分野根据水解片段的大小和相应电泳位置可区分野生型和突变型靶基因片段生型和突变型靶基因片段一、一、 PCR- PCR-限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性EcoRI 水解水解      A                                B                                C A                                  B                              C一、一、 PCR- PCR-限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性二、等位基因特异性寡核苷酸二、等位基因特异性寡核苷酸•用寡核苷酸探针和用寡核苷酸探针和PCRPCR产物进展杂交检测点突产物进展杂交检测点突变的技术变的技术•被检靶片段经被检靶片段经PCRPCR扩增并经电泳分别后转移到扩增并经电泳分别后转移到膜上，分别与经标志的野生型和突变型靶基因膜上，分别与经标志的野生型和突变型靶基因序列的寡核苷酸探针杂交序列的寡核苷酸探针杂交•PCRPCR产物仅与完全互补的探针进展杂交产物仅与完全互补的探针进展杂交•含突变序列的产物仅与突变探针杂交含突变序列的产物仅与突变探针杂交•根据有无杂交信号判别被检扩增片段中根据有无杂交信号判别被检扩增片段中能否带有突变点能否带有突变点二、等位基因特异性寡核苷酸二、等位基因特异性寡核苷酸二、等位基因特异性寡核苷酸二、等位基因特异性寡核苷酸不同顺序不同顺序 不同构象不同构象 不同电泳行为不同电泳行为三、单链构象多态性三、单链构象多态性• 单链单链DNADNA分子的空间构象，取决于该分子本身分子的空间构象，取决于该分子本身的碱基组成的碱基组成 • 突变突变DNADNA的的PCRPCR产物经变性后产生与正常产物经变性后产生与正常DNADNA空空间构象不同的两条单链间构象不同的两条单链 • 不同构象的单链片段具有不同的电泳迁移率，不同构象的单链片段具有不同的电泳迁移率，因此能区别正常与突变的因此能区别正常与突变的DNA DNA  SSCP技术检测技术检测DNA突变突变三、单链构象多态性三、单链构象多态性•DGGEDGGE是一种挑选单碱基突变及多态性的方法是一种挑选单碱基突变及多态性的方法 •DNADNA分子被加热至其融点温度时双链被部分解链。

分子被加热至其融点温度时双链被部分解链融点温度取决于融点温度取决于DNADNA分子本身的序列，野生型和突分子本身的序列，野生型和突变型变型DNADNA双链具有不同的融点温度双链具有不同的融点温度 四、变性梯度凝胶电泳四、变性梯度凝胶电泳•设计引物时使被扩增的靶基因片段的二端含设计引物时使被扩增的靶基因片段的二端含有不同的有不同的TmTm值值 •将将PCRPCR产物在含有梯度浓度变性剂的聚丙烯酰产物在含有梯度浓度变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中电泳胺凝胶中电泳 •当泳动至变性剂相应浓度的位置时，产物片当泳动至变性剂相应浓度的位置时，产物片段中段中TmTm值较低一端的双链被部分解链，使该值较低一端的双链被部分解链，使该片段的电泳迁移率大大降低片段的电泳迁移率大大降低 四、变性梯度凝胶电泳四、变性梯度凝胶电泳•野生序列的野生序列的PCRPCR产物片段与突变序列的产物片段与突变序列的PCRPCR产产物片段的物片段的TmTm不同，它们在电泳过程中被部分不同，它们在电泳过程中被部分解链的先后不同，经过一定时间的电泳后，解链的先后不同，经过一定时间的电泳后，可以发现这些产物片段在凝胶中所处的位置可以发现这些产物片段在凝胶中所处的位置也不同也不同 四、变性梯度凝胶电泳四、变性梯度凝胶电泳ABCABC四、变性梯度凝胶电泳四、变性梯度凝胶电泳五、熔点曲线分析五、熔点曲线分析•DNADNA片段中突变碱基与正常碱基不能配对而构成片段中突变碱基与正常碱基不能配对而构成异源双链，所产生的异源双链，所产生的TmTm较完全配对的同源双链较完全配对的同源双链的的TmTm低，而显示出不同的曲线，从而将突变序低，而显示出不同的曲线，从而将突变序列检测出来列检测出来•根据熔点曲线可判别野生型或突变型根据熔点曲线可判别野生型或突变型DNADNA片段片段五、熔点曲线分析五、熔点曲线分析六、六、PCRPCR产物的序列分析产物的序列分析•主要用于分子克隆时对于目的基因扩增片段的主要用于分子克隆时对于目的基因扩增片段的序列鉴定以及对致病基因检测时分析扩增片段序列鉴定以及对致病基因检测时分析扩增片段中点突变的位置和性质中点突变的位置和性质 • •测序战略：测序战略：•产物纯化后作为模板直接测序产物纯化后作为模板直接测序•将将PCRPCR产物克隆入载体后再测序，后者测序的产物克隆入载体后再测序，后者测序的效果更好效果更好 ，如，如A-TA-T克隆克隆。