尿中多环芳烃测定课件.ppt

尿中多环芳烃尿中多环芳烃（（PAH)四种羟基代谢物四种羟基代谢物------高效液相色谱法高效液相色谱法(HPLC)杨玲杨玲 刘丹丹刘丹丹 康静康静多环芳烃简介l多环芳烃(PAHs) 是人类最早发现的一类环境有机致癌化合物PAHs 广泛存在于空气颗粒物和烟熏烧烤类食品中另外,香烟烟雾中也含有高浓度的PAHsPAHs 种类繁多、在环境中分布广,主要通过呼吸道、消化道和皮肤进入人体,经体内代谢转化后,生成DNA 加合物PAHs 与人们的生活息息相关，在致癌类化合物中占有相当重要的地位 检测指标l那么如何评估人体内外PAHs的暴露量呢？ 目前使用较多的是生物标志物法，即通过测人体组织或体液中的PAHs或其代谢产物综合反映人体对PAHs的暴露情况许多生物标记物，包括PAH-DNA、PAH-蛋白质、PAH尿代谢物等，都被用于衡量人体PAHs暴露量PAH进入人体后，经代谢形成多种代谢产物可通进入人体后，经代谢形成多种代谢产物可通过测定尿中四中代谢产物来反应内暴露情况过测定尿中四中代谢产物来反应内暴露情况 2-羟基萘 2-羟基芴 9-羟基菲 1-羟基芘l 1—羟基芘羟基芘是常用的生物标志物，它是芘的主要代谢物，在尿样中通常以葡萄糖醛酸酯和芳基硫酸酯的形式存在。

l用用HPLC来进行四种物质的定量测定，需在上机前对样品进行严格的来进行四种物质的定量测定，需在上机前对样品进行严格的处理上机前尿样处理步骤上机前尿样处理步骤：取尿样取尿样6ml于于15ml离心管离心管离心离心2000rpm/min10min取上清取上清5ml,调调PH5.00—5.09后，加醋酸盐缓冲液后，加醋酸盐缓冲液和和β-葡萄糖醛酸酶葡萄糖醛酸酶37℃℃水浴摇床，水浴摇床，14h离心后，进行固相萃取离心后，进行固相萃取固相萃取用的装置固相萃取用碳固相萃取用碳18柱柱碳碳18颗粒颗粒第一步：活化（第一步：活化（5ml纯甲醇）纯甲醇）第二步：平衡（第二步：平衡（5ml超纯水）超纯水）注意：每一步操作要在上一步注意：每一步操作要在上一步液体到达上筛板之前加入！液体到达上筛板之前加入！调节滴速调节滴速每秒每秒3-4滴滴上样上样l第一步第一步：吸附：吸附l（（5ml尿样）尿样）l第二步第二步：清洗：清洗l（（10ml超纯水）超纯水）l（（10ml30%甲醇）甲醇）洗脱洗脱l加两次加两次3ml纯甲醇纯甲醇l记录每个试管液面高记录每个试管液面高度（度（6ml左右）左右）氮吹l用氮气将试管吹干用氮气将试管吹干l（（6小时左右）小时左右）l用用70%甲醇甲醇1ml溶解后溶解后倒入倒入1.5mlEP管中，上管中，上机前先离心，取机前先离心，取200ul于棕色瓶。

于棕色瓶上机高效液相色谱法高效液相色谱法l色谱法的原理色谱法的原理：利用混合物在流动相（甲醇）和固定相：利用混合物在流动相（甲醇）和固定相（碳（碳18）中）中分配系数分配系数不同，使固定相（碳不同，使固定相（碳18）对各组分（）对各组分（ 1—羟基芘羟基芘 、、9—羟基菲、羟基菲、2—羟基芴、羟基芴、2—羟基萘）羟基萘）的保留作用不同，产生的保留作用不同，产生差速迁移差速迁移，使各组分得到分离流，使各组分得到分离流动相在开机前需进行动相在开机前需进行脱气脱气处理l差速迁移差速迁移：在色谱分离过程中，当流动相携带试样对固定：在色谱分离过程中，当流动相携带试样对固定相作相对运动时，由于试样中各组分在固定相和流动相之相作相对运动时，由于试样中各组分在固定相和流动相之间的作用力（如吸附力、溶解力、离子交换力、分子排阻间的作用力（如吸附力、溶解力、离子交换力、分子排阻力和亲和力等）有微小差别，使得不同组分被流动相运载力和亲和力等）有微小差别，使得不同组分被流动相运载移动的速率不同，产生差速迁移，致使性质有微小差异的移动的速率不同，产生差速迁移，致使性质有微小差异的不同组分被分离不同组分被分离。

组分分配在固定相中的浓度组分分配在固定相中的浓度组分分配在流动相中的浓度组分分配在流动相中的浓度K=K值大小与组分的保留时间有关，即与峰形出现的时间有关值大小与组分的保留时间有关，即与峰形出现的时间有关分配系数分配系数：在一定温度和压力条件下，组分在固定：在一定温度和压力条件下，组分在固定相和流动相之间的分配达到平衡时，组分分配在固相和流动相之间的分配达到平衡时，组分分配在固定相与其分配在流动相中的平均浓度之比定相与其分配在流动相中的平均浓度之比高效液相色谱法高效液相色谱法l是利用高压输液泵驱使流动相（甲醇）通过是利用高压输液泵驱使流动相（甲醇）通过装填固定相（碳装填固定相（碳18）的色谱柱，按照固液）的色谱柱，按照固液相之间的分配机制对混合物进行分离的方相之间的分配机制对混合物进行分离的方法l液固吸附色谱法液固吸附色谱法 在吸附色谱中，组分分子和流动相分子在吸附色谱中，组分分子和流动相分子对吸附剂（固定相）表面产生竞争性吸附，对吸附剂（固定相）表面产生竞争性吸附，利用组分和固定相吸附力的不同而分离利用组分和固定相吸附力的不同而分离高压输液系统高压输液系统进样系统进样系统分离系统分离系统检测系统检测系统贮液瓶贮液瓶高压输高压输液泵液泵梯度洗梯度洗脱装置脱装置色谱柱色谱柱高效液相色谱仪的工作流程：高效液相色谱仪的工作流程：l高压泵高压泵将贮液器中经过过滤和脱气的流动相将贮液器中经过过滤和脱气的流动相经由经由进样器进样器送入色谱柱，然后从送入色谱柱，然后从检测器检测器流流出。

出l当注入欲分离的样品时，流经当注入欲分离的样品时，流经进样器进样器的流动的流动相将样品带入相将样品带入色谱柱色谱柱中进行分离分离后中进行分离分离后的各组分依先后顺序进入检测器，的各组分依先后顺序进入检测器，检测器检测器将个组分浓度信号转变为易于测量的电信将个组分浓度信号转变为易于测量的电信号，经色谱工作站处理得到号，经色谱工作站处理得到色谱图色谱图梯度洗脱装置（溶剂程序）梯度洗脱装置（溶剂程序）l在分离过程中，流动相的组成随时间改变而在分离过程中，流动相的组成随时间改变而改变，按一定程序不断改变流动相（甲醇）改变，按一定程序不断改变流动相（甲醇）的配比，使溶剂极性、离子强度或的配比，使溶剂极性、离子强度或pH值改值改变，使被测组分的相对保留值得以改变，变，使被测组分的相对保留值得以改变，从而改进复杂样品的分离，改善峰形、缩从而改进复杂样品的分离，改善峰形、缩短分析时间，提高分离效率短分析时间，提高分离效率l本实验选择本实验选择荧光检测器荧光检测器，因为其对温度和流，因为其对温度和流动相流速的变化不敏感，可以进行梯度洗动相流速的变化不敏感，可以进行梯度洗脱溶剂的梯度洗脱程序荧光检测器波长的选择荧光检测器波长的选择l2---羟基萘羟基萘Ex：：227nm Em：：335nml2—羟基芴羟基芴Ex：：275nm Em：：330nml9---羟基菲羟基菲Ex：：255nm Em：：385nml1—羟基芘羟基芘Ex：：242nm Em：：396nm柱温色谱图色谱图：： 是电信号对时间的曲线，又称色谱流是电信号对时间的曲线，又称色谱流出曲线。

出曲线l色谱峰色谱峰：色谱图中最突出的部分色谱图中最突出的部分l正常的色谱峰，是对称正态分布的曲线正常的色谱峰，是对称正态分布的曲线l基线基线：仅有流动相通过检测器时，仪器记录：仅有流动相通过检测器时，仪器记录的响应信号曲线的响应信号曲线l横坐标横坐标：保留时间：保留时间(T)，组分从进样到出现，组分从进样到出现信号最大值的时间信号最大值的时间l纵坐标纵坐标：响应信号（：响应信号（LU)重要参数重要参数l定性参数定性参数：保留值（保留时间：保留值（保留时间t））l定量参数定量参数：： 峰面积峰面积s：峰与峰底之间的面积峰与峰底之间的面积 峰高峰高h：色谱峰最高点至峰底之间的距：色谱峰最高点至峰底之间的距离 缝宽缝宽w：色谱峰两侧拐点处的切线在基：色谱峰两侧拐点处的切线在基线上截取的距离线上截取的距离色谱峰的甄选：色谱峰的甄选：。