ELISA所需缓冲液的配方.doc

一、做ELISA确定抗原最佳包被浓度，做方阵滴定具体怎么做呢？选择好一份已知为阳性和阴性背景的标本，将你的抗原用1*CBPH=9.6或1*PBPH=7.4进行倍比稀释（8个条件）后加入96孔板每孔100ul°（—般包被浓度lOOng抗原或抗体/孔，最优包被条件需进行试验选择）4度过夜取出后甩干，加入20%NBS封闭每孔200ul37度2h热封，甩去后拍干即可将你HRP或AP标记的抗原或二抗用酶标稀释液进行稀释（倍比稀释4个梯度）即可棋盘滴定就是板酶交叉，同时带上阳性、阴性通过试验确定最佳P/N的包被搭配E的试验2．抗原和抗体最佳工作浓度的确定抗原抗体反应要求在最适比例条件下进行，ELISA反应试剂多，其工作浓度不同对结果影响较大，因此必须对包被抗原（抗体）和酶标抗体（抗原）进行最佳工作浓度的滴定和选择，以达到最佳的测定条件1）方阵（棋盘）滴定法选择包被抗原的工作浓度用包被液将抗原作一系列稀释（1:50〜1:800）后，按行进行包被、洗涤按列分别加入用稀释液1:100稀释的强阳性、弱阳性、阴性参考血清及稀释液（作空白对照），保温，洗涤加工作浓度酶标抗体，洗涤，加底物显色，加酸终止反应后读取A值。

选择强阳性参考血清A值；为0.8左右，阴性参考血清A值〈0.1的包被抗原稀释度为工作浓度方阵（棋盘）法选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度将抗体用包被液稀释为10mg/L、lmg/L、0.1mg/L三个浓度按行包被，每一个浓度包被三行侮行3孔），分别在每个浓度包被的第一、二、三行中分别加入强阳性抗原，弱阳性抗原和阴性对照，将酶标抗抗体用稀释液稀释为1:1000、1:5000、1:10000三个浓度，分别加入每个浓度包被的第一、二、三列中加底物显色，加酸终止反应，分别读取A值以强阳性抗原液A值在0.8左右，阴性参考A值〈0.1的条件为最适条件据此选择包被抗体和酶标抗体的最佳工作浓度二、ELISA最适工作浓度的选择及标准化操作1最适工作浓度的选择1.1间接法测抗体酶标抗体工作浓度的选择：①用igG进行包被，洗涤②将酶标IgG用稀释液作一系列稀释后分别加入已包被的孔中，保温、洗涤③加酸终止反应后，读取吸光度(A)读取A值在1.0时的酶标抗体稀释度，作为酶标抗体的工作浓度该酶标IsC的工作浓度应为1/1600棋盘滴定法选择包被抗原工作浓度：①用包被液将抗原由1：50开始作比倍稀释后进行包被，洗涤②将强阳性参考血清、弱阳性参考血清和阴性参考血清用稀释液作1：100稀释，加样，保温、洗涤。

③加按工作浓度稀释的酶标IsC抗体，保温、洗涤④加底物显色加酸终止反应后读取A值⑤选择强阳性参考血清的A值为0.8左右、阴性参考血清的A值小于0.1的包被抗的稀释度作为工作浓度，从中选取最适工作浓度1.2夹心法测抗原在夹心ELISA法中，可用棋盘滴定法同时选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度①抗体免疫球蛋白用包被缓冲液稀释至蛋白浓度为10.0、1.0和0.1微克/毫升，分别在ELISA板上进行包被，每一浓度包括3个纵行，洗涤②在1个横行各包被孔中加入强阳性抗原液，另1横行加入弱阳性抗原液，第3横行加入阴性对照液，保温、洗涤③将酶标抗体用稀释液稀释成3个浓度，例如1：1000、1：5000和1：25000分别加入每个包被浓度的1个纵行中，保温、洗涤④加底物显色加酸终止反应后，读取A值⑤以强阳性抗原的A值在0.8左右、阴性参考的A值小于0.1的条件作最适条件，据此选择包被抗体和酶抗体的工作浓度，从中选取包被抗体浓度和酶标抗体的稀释度为了进一步节省试剂，可以此浓度为基点，缩小间距再进一步做棋盘滴定2测定方法的标准化2.1加样ELISA中除了包被外，一般需进行96孔加样定性测定中有时不强调加样量的准确性。

例如规定为加样1滴，如不具备相当的条件，要尽量使用相同口径的滴管，保持准确的加样姿势，使每滴液体的体积基本相同在定量测定中，加样量应力求准确，最好采用量程准确的微量移液器加样时应将液体加在孔底，不要加在孔壁上部，避免出现气泡2.2保温在ELISA中，一般在加标本和结合物后，反应的温度和时间应按规定的要求，保温容器最好是水浴箱，可使温度迅速平衡各ELISA板不应叠在一起为避免蒸发，板上应加盖，或将板平放在底部垫有湿纱布的湿盒中如用保温箱，空湿盒应预先放在其，以平衡温度2.3洗涤洗涤在ELISA过程中不是反应步骤，但却是决定实验成败的关键在标本和结合物的稀释液和洗涤液中加入聚山梨酯一类物质即避免非特异性吸附，在ELISA中最为常用ELISA板的洗涤一般可采用以下方法：吸干孑L内反应液；将洗涤液注满板孔；放置2分钟，略作摇动；吸干孔内液，也可倾去液体后在吸水纸上拍干洗涤的次数一般为3-4次，有时甚至需洗5-6次如有专用洗涤机，应设定标准的洗涤步骤，并定期检查洗涤液，保证洗涤质量2.4比色阴性对照颜色极浅，在定性测定中一般可采用目视比色在目测法中，待检血清与抗原对照反应孔和待检血清与特异抗原反应孔均呈无色或极浅色，判为阴性；待检血清与抗原对照反应孔无色或极浅色而与特异抗原呈橘黄色，判为阳性。

如用比色计测定结果，其准确性则决定于ELISA板底的平整与透明度和比色计的质量三、ELISA法抗原包被的浓度如何确定？ELISA法进行抗原包被的时候，抗原包被的浓度是如何确定的看到有些资料中方阵滴定法，稀释抗原和血清，以强阳性抗原液A值在0.8左右，阴性参考A值＜0.1的条件为最适条件为什么选择这个为最适条件？弱阳性血清有什么用处？在摸索包被浓度的时候，血清中抗体的含量是固定的吗？需要提前定值吗？急需答案一般我们做的时候抗原抗体两个变量，抗原的浓度是根据你的抗原的纯度来定的，一般纯化的蛋白是2ng，有时候是要抗体的滴度，抗原浓度固定，抗体或者血清就要拉稀释度，这和酶标仪的灵敏性有关.一般OD值在1.0左右酶标仪比较灵敏，测量的数据比较准确.OD值如果很深，达到2点几就不灵敏了•所以我们一般选OD值在1.0左右进行分析.OD1.0-1.5之间最佳，当然依据酶标仪的性能而定个人觉得棋盘ELISA一定要选择OD1.0的点是个误区首先不同型号的灵敏度应该是不一样的；其次OD为1.0指的是某个抗原抗体浓度条件下的OD值，并不代表通过此次棋盘得到的最佳抗原抗体的浓度所做的各种后续ELISA实验的值也是1.0左右，所以说选择处于酶标仪灵敏度的最佳状况并不一定符合后续的实验。

不善表达，不知自己描述清楚没有）我自己觉得要根据不同的实验类型（间接，双抗夹心或是竞争等）来选择最佳抗原抗体工作浓度象竞争ELISA，做棋盘的目的是包被抗原和一抗的量，试想如果包被抗原太浓，意味着需要竞争抗原浓度也不能小（毕竟是竞争对手不能悬殊太大），这就注定了竞争ELISA的检测限不好（因为竞争抗原往往是要检测的东西，所需浓度越大IC50也就越大）而一抗也不能足量，否则即能与包被抗原反应又能与检测抗原反应，就不能称为竞争ELISA了也不能太少，否则整体OD读数太低双抗夹心ELISA也是同样的道理，找到包被抗体和酶标抗体的平衡点，即能OD与本底之间的平衡点四、elisa试剂盒Elisa试验是一种敏感性高，特异性强，重复性好的实验诊断方法由于其试剂稳定、易保存，操作简便，结果判断较客观等因素，已广泛应用在免疫学检验的各领域中ELISA检测试剂盒是用于体外定性检测人血清或血浆中的抗人类戊型肝炎（HEV）病毒IgM抗体ELISA检测一）、ELISA简介ELISAMWutfiqnivini畚*垫s耳i—elisa技术流程ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。

在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体然而，影响Elisa试验结果的因素很多，故加强各个环节的质量保证才能充分发挥其方法学的优点二）Elisa试剂盒测定技术的发展口临床测定技术的发展主要在于方法学的发展，而方法学的发展依托于试剂生产技术不断进步更新和型标记物的应用目前，分子生物学正在并最终肯定会让我们对整个生命科学有一个全面而彻底的认识，其对免疫测定技术发展的影响也是直接而又有效的，它使我们对以前一些难以检测的生物活性物质的测定变得轻而易举，并且大大提高了检测的灵敏度和特异性三）基因工程试剂对免疫测定技术发展的影响免疫测定技术的基础在于抗原抗体之间的特异结合反应，所以任何优质的诊断试剂离不开优质的原料，如抗原抗体，酶等。

以前用于免疫测定的抗原通常为各种纯化抗原，而抗体则为纯化抗原免疫动物后获得的多克隆抗体和使用杂交瘤技术得到的单克隆抗体，而抗原或抗体的标记物如酶标结合物则通过各种化学合成方法制备近年来，随着分子生物学的发展，使用基因工程方法制备各种特殊的抗原或抗体及其酶结合物等免疫测定试剂几成为现实的新一代试剂，各种新型使用的测定方法也不断出现HBsAg试剂特点（检测模式：临床抗体夹心法）：包被抗体为山羊多抗多抗具有高亲和性和对抗原各种表位的反应性酶表抗体为与HBsAg有不同结合位点的鼠复合单位，可测得HBsAg变异样品，提高检测的特异性（99.98%）提高检测的灵敏度，应用PariEhrich学说（PEI）HBsAg标准品，对ad标准品的灵敏度为0.05ng/ml对ay标准品灵敏度为0.025ng/mi（四）测试剂盒检测原理ELISA检测试剂盒应用定性夹心免疫检测技术，用合成的HEV多肽抗原包被微孔板板条，这些多肽是中国型HEV毒株核心氨基酸序列中抗原性很强的肽段，分别来自于该毒株的开放阅读框2和开放阅读框3将样品或标准品加入孔中并孵育，如果其中存在HEVIgM抗体，这些抗体就会与HEV的多肽抗原结合，并固定在上面，洗板除去其它非特异性抗体和样品中的其它成份。

然后加入羊抗人IgM-HRP（辣根过氧化物酶）酶结合物，经第二次孵育后，酶结合物就会与第一次孵育结合上的HEVIgM抗体相结合，洗板除去未结合的酶结合物，加入TMB底物溶液，在第三次孵育时会发生酶-底物反应，只有那些含有HEVIgM抗体和酶结合物所形成的复合物的孔才会发生颜色变化，加入硫酸溶液终止酶和底物间的反应，并在波长：450nm处测量O.D.值,按照本HEVIgM抗体elisa试剂盒的测试标准，O.D.值大于或等于Cut-Off值的样品被认为是初试阳性五）操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法1. 包被:用0.05MPH9•牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1〜10pg/mlo在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml,4°C过夜次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟简称洗涤，下同）2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37C孵育1小时然后洗涤同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）3. 加酶标抗体:于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml37C孵育0.5〜1小时，洗涤4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml,37C10〜30分钟。

5. 终止反应：于各反应孔中加入2M。