CAT的活性测定-紫外吸收法.pdf

1 过氧化氢酶的活性测定紫外吸收法 一、仪器与用具 紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml 容量瓶 1 个；刻度吸管2 支， 2ml 刻度吸 管 1 支； 10ml 试管 3 支；恒温水浴； 二、试剂 L 磷酸缓冲液 L H2O2（用 L 高锰酸钾标定） L H2O2：市售 30%H2O2大约等于L，取 30%H 2O2溶液，稀释至1000ml，用标准 L KMnO4 溶液（在酸性条件下）进行标定； L 高锰酸钾标准液称：取KMnO4（AR ） ，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，再用 L 草酸溶液标定； L 草酸：称取优级纯，用蒸馏水溶解后，定容至1000ml 三、步骤 1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织置研钵中，加入23ml 4 下预 冷的磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入10ml 离心管中，并用缓冲液冲洗研钵数 次，合并冲洗液置5冰箱中静置10min，在 4000rpm 下离心15min，上清液即为过氧化 氢酶粗提液 5下保存备用 2. 测定：取 10ml 试管 3 支，其中 2 支为样品测定管，1 支为空白管，按表40-2 顺序加 入试剂 表 40-2 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表 管号S0S1S2 粗酶液 (ml) 磷酸 (ml) 蒸馏水 (ml) 25预热后 , 逐管加入 L 的 H2O2， 每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm 下测定吸光度，每隔1min 读数 1 次，共测4min，待 3支管全部测定完后，按下式计算酶活 性。

四、结果计算： 以 1min 内 A240减少的酶量为1 个酶活单位（ u） 过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=FWtV. VA T 1 240 10 式中A240 = AS0 ()AA SS12 2 AS0加入煮死酶液的对照管吸光值； AS1, AS2样品管吸光值； Vt粗酶提取液总体积（ml） ； V 1测定用粗酶液体积（ml） ； FW样品鲜重（g） ； A240每下降为 1 个酶活单位（ u） ； t加过氧化氢到最后一次读数时间（min） 。